人外周血单个核细胞分离与E花环实验.ppt

**外周血单个核细胞的分离与E花环形成实验实验课的目的与内容了解免疫细胞分离的原理、基本方法、以及应用。细胞分离技术。E玫瑰花环形成实验免疫细胞免疫细胞：不均一的细胞群体，主要包括淋巴细胞、抗原递呈细胞、各种粒细胞等。检测意义：通过数量和功能的检测（主要是T细胞），可以判断机体的细胞免疫水平，应用于临床疾病的诊断、探讨发病机制、观察病情的变化、判断预后、考核疗效等。免疫细胞分离技术原理：依据细胞的物理学性状（如密度、黏附能力等）以及细胞表面标志等存在差异而得以实现，继单克隆抗体问世后又产生了单细胞分离、磁珠分离和流式细胞仪分选等技术。获得高纯度、高活力的免疫细胞是检测和研究细胞表型和功能的基础。标本：对于淋巴细胞而言，外周血、免疫器官等标本。外周血单个核细胞的分离概念：peripheralbloodmononuclearcell、PBMC，淋巴细胞和单核细胞构成。原理：依据比重不同而分离，如红细胞和粒细胞（1.093和1.092），人类PBMC（1.075-1.090），淋巴细胞分离液（Ficoll分离液、1.075-1.092），通过离心使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将淋巴细胞分离出来。不同细胞密度不同主要试剂和仪器肝素溶液：用生理盐水将肝素配制成125～250U/ml的溶液,置4℃下保存备用。淋巴细胞分层液：市售,20℃时密度应1.077±0.001g/L。Hanks平衡盐溶液（无钙镁）,pH7.2～7.4。离心管、水平离心机、刻度吸管等。操作步骤一采血：采集静脉血6-7ml，注入盛有肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀，使血液抗凝。取2ml血，用于收集血浆，以用于后续实验检测。剩余血液，用吸管加入等体积的室温Hanks平衡盐溶液，使血液等倍稀释，用于本次外周血单个核细胞的分离实验。分组说明（4人/大组；2人/小组）采血：采集静脉血6-7ml，注入盛有肝素的无菌小瓶中，加盖后立即轻轻摇匀，使血液抗凝。取2ml血，用于收集血浆，以用于后续实验检测（大组共用）。剩余约4ml血液，用吸管加入等体积的室温Hanks平衡盐溶液，即8ml血液。（2人/小组，每小组4ml血液）操作步骤二细胞分离：在离心管中加入适量分离液（当稀释后血液体积小于3mL时，加入3mL分离液；大于等于3mL，加入等体积分离液。但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果）。操作步骤二细胞分离：将稀释后的血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多加样时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。操作步骤三细胞离心：室温，水平转子500~1000g，离心20~30min（血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g）。400g，30min，升降加速度设为1，中途不可停止。！将用于后续实验的血液样本3000rpm，离心10min，后轻拿，吸取离心后血浆至新的1.5ml离心管中，做好标记存储。操作步骤四细胞位置：离心后,管内可分为以下四层:上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板，中层为细胞分离液，下层为红细胞及粒细胞，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层（PBMC）。收获细胞：用毛细吸管轻轻插入白膜层，吸出白膜层的细胞，盛入另一支15ml离心管中。密度梯度离心法离心前离心后稀释抗凝血淋巴细胞分离液血浆单个核细胞粒细胞红细胞操作步骤五细胞洗涤：小心的吸取白膜层细胞到15mL洁净的离心管中，加入10mLhanks溶液洗涤白膜层细胞。1500rpm，离心10min。细胞洗涤：弃上清,重新加入5mLhanks溶液重悬细胞，1500rpm，离心10min。操作步骤五细胞洗涤：重复上一步，弃上清,重新加入5mLhanks溶液重悬细胞，1500rpm，离心5min。小心弃去上清，重新加入200ulhanks溶液