2025年基因表达载体构建中限制酶挑选策略详解.doc

限制酶选择的三大根据

1.根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类

图1

(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶,以便将目的基因“切出”,如图甲可选择PstⅠ(目的基因两端均具PstⅠ)。

(2)不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,以防破坏目的基因,如图甲不能选择SmaⅠ。

(2)為防止目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不一样的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要保证质粒上也有这两种酶的切点),并且这种切点不至于完全破坏“标识基因”。

2.根据质粒的特点确定限制酶的种类

(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致,以保证具有相似的黏性末端。

(2)质粒作為载体必须具有标识基因等,因此所选择的限制酶尽量不要破坏这些构造,应至少具有一种完好的标识基因,如图2中限制酶pstⅠ因其会破坏该质粒上唯一的标识基因而不适宜选择。

(3)所选限制酶切点不应位于复制原点处以防破坏复制原点(如图2中KpnⅠ)。假如所选酶的切点不止一种,则切割重组后也許会丢失某些片段——若丢失的片段含复制起点区,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

(4)所选限制酶,其切点应位于启动子与终止子之间,如图2中HindⅢ会破坏启动子,EcoRⅠ会破坏终止子,而NdeⅠ和BamHⅠ切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间。

3.参照Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶

若质粒上标出T－DNA片段,则所选限制酶切点应位于T－DNA片段中,从而有助于将目的基因嵌入到T－DNA片段上——由于Ti质粒的T－DNA片段最易转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上,从而实現“转化”。如用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不一样)切割某DNA,获得含目的基因的片段。若运用该片段构建基因体現载体,则甲～丁四种Ti质粒中宜选择“丙”作载体,而不适宜选择甲、乙、丁。(分析如下)

1.(·全国卷Ⅲ,40)图(a)中的三个DNA片段上依次表达出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点,图(b)為某种体現载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。

根据基因工程的有关知识,回答问題:

(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述体現载体被酶切后的产物连接,理由是________________________________________________________

_____________________________________________________________________。

(2)若某人运用图(b)所示的体現载体获得了甲、乙、丙三种具有目的基因的重组DNA分子,如图(c)所示,这三种重组DNA分子中,不能在宿主细胞中体現目的基因产物的有,不能体現的原因是_______________________________

____________________________________________________________________。

图(c)

(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶,常見的有和,其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是_______________________________。

[慧眼识图获取信息]

(1)三种限制酶切割成果分析

(2)基因体現载体分析

答案(1)Sau3AⅠ两种酶切割后产生的片段具有相似的黏性末端(2)甲、丙甲中目的基因插入在启动子的上游,丙中目的基因插入在终止子的下游,两者的目的基因均不能被转录(3)E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶T4DNA连接酶

2.(·经典高考)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点,图1、图2中标注了有关限制酶的酶切位点,其中切割位点相似的酶不反复标注。請回答问題:

(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒,应选用两种限制酶切割,酶切后的载体和目的基因片段,通过酶作用后获得重组质粒。為了扩增重组质粒,需将其转入处在态的大肠杆菌。

(2)為了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌,应在筛选平板培养基中添加,平板上長出的菌落,常用PCR鉴定,所用的引物构成為图2中。

(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接,连接部位的6个碱基对序列為,对于该部位,这两种酶(填“都能”、“都不能”或“只有一种能”)切开。

(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多也許获得种大小不一样的DNA片段。

审題指导

第一步:首先看目的基因两侧有何种切割位点以保障能将目的基因“切出”

如图2使用BamHⅠ、BclⅠ