生化大实验实验聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳.pptVIP

纯度检测：

1.SDS测定LDL纯度

2.双向免疫扩散测定LDL纯度含量测定：1.Folin-酚试剂法测定LDL含量SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析LDL纯度学习电泳原理和技术学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳（SDS）分离蛋白质技术0201一、目的要求电泳概述：电泳：带电荷的质点，在一定条件的电场作用下，可向一极移动，如带正电荷的质点移向负极，这种现象称为电泳。影响电泳的主要因素：1）电泳介质的pH2）缓冲液的离子强度3）电场强度4）电渗作用5）对支持物的选择6）温度对电泳的影响电泳分类：按原理分：区带电泳、移界电泳、等速电泳、聚焦电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂N，N，N?，N?—四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(APS)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的区带电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对pH和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。表3.4分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋白质?104 20-30 1-4×104 15-201-5×104-1×105 10-15 1×105 5-10 ?5×105 2-5 核酸(RNA) ?104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。01目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。02样品胶pH6.7(2)浓缩胶pH6.7分离胶pH8.9(4)电极缓冲液pH8.3(A为正面,B为剖面)010203图1聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图01040203图2夹心垂直板电泳槽示意图导线接头2.下贮槽3.凹形橡胶框4.样品槽模板5.固定螺丝上贮槽7.冷凝系统

图3凝胶模示意图1.样品槽模板2.长玻璃板3.短玻璃板4.凹形橡胶框返回不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由APS催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由APS催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。不连续凝胶分离蛋白质原理：（1）样品浓缩效应(a)凝胶孔径不连续性：(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；在pH6.7的凝胶缓冲体系中前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)尾随离子(trailingion)或慢离子：甘氨酸根mcl?clmp?pmG?G(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m?，m为迁移率，?为解离度)当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；（c)电位梯度的不连续性：(2)分子筛效应(3)电荷效应A为电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快