自学内容1基因工程基本操作.pptVIP

DEPC使用方法2011-9-24基因工程基本操作*DEPC是RNase的化学修饰剂,它和RNase的活性基团（组氨酸的咪唑环）反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制.无RNase灭菌水：用经高温烘烤的玻璃瓶装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。提取方法2011-9-24基因工程基本操作*1mRNA纯化：3‘末端ploy(A)tail32Trizol法异硫氰酸胍热苯酚法（一）动植物总RNA提取——Trizol法RNase封阻分析Poly(A)-mRNA分离Northern优点：无蛋白和DNA污染体外翻译斑点杂交用途：适用范围:人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，(mg—g)3241组织液氮研磨0.2mL氯仿/1mLTrizol室温放置5分钟，加Trizol（1mLTrizol/50-100mg材料）离心取上清0.5mL异丙醇/mLTrizol室温放置10min，离心取沉淀75%乙醇洗沉淀，干燥原理：（二）mRNA纯化2011-9-24基因工程基本操作*mRNA3’末端------poly(A)+01020304oligo(dT)纤维素---oligd(T)高盐缓冲液，mRNA特异的吸附低盐浓度或蒸馏水中，mRNA洗脱05两次oligo(dT)纤维素柱，可得到较纯的mRNA基因工程基本操作基因工程基本操作****1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

4、弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

4、弃去上清液，按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

*1、取一eppendorf管加入提纯TMV（10mg/ml)400μl，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1分钟，4℃下12000g离心10分钟。

2、吸取水相于一新eppendorf管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。

3、吸取水相于新eppendorf管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g离心10分钟。

4、取水相，加入1/10倍体积的3mol/LNaAc(pH5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。

第六章

基因工程的主要操作原理2011-9-24基因工程基本操作*第一节DNA提取（一）总DNA的提取大肠杆菌总DNA提取植物总DNA提取动物总DNA提取质粒DNA提取噬菌体D