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DEPC使用方法2011-9-24基因工程基本操作*DEPC是RNase的化学修饰剂,它和RNase的活性基团(组氨酸的咪唑环)反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制.无RNase灭菌水:用经高温烘烤的玻璃瓶装蒸馏水,然后加入0.01%的DEPC(体积/体积),处理过夜后高压灭菌。75%乙醇:用DEPC处理水配制75%乙醇,(用高温灭菌器皿配制),然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱。提取方法2011-9-24基因工程基本操作*1mRNA纯化:3‘末端ploy(A)tail32Trizol法异硫氰酸胍热苯酚法(一)动植物总RNA提取——Trizol法RNase封阻分析Poly(A)-mRNA分离Northern优点:无蛋白和DNA污染体外翻译斑点杂交用途:适用范围:人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,(mg—g)3241组织液氮研磨0.2mL氯仿/1mLTrizol室温放置5分钟,加Trizol(1mLTrizol/50-100mg材料)离心取上清0.5mL异丙醇/mLTrizol室温放置10min,离心取沉淀75%乙醇洗沉淀,干燥原理:(二)mRNA纯化2011-9-24基因工程基本操作*mRNA3’末端------poly(A)+01020304oligo(dT)纤维素---oligd(T)高盐缓冲液,mRNA特异的吸附低盐浓度或蒸馏水中,mRNA洗脱05两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA基因工程基本操作基因工程基本操作****1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
4、弃去上清液,按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
4、弃去上清液,按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶10分钟。RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
*1、取一eppendorf管加入提纯TMV(10mg/ml)400μl,再加入等体积酚/氯仿,盖紧管盖后用手充分振荡1分钟,4℃下12000g离心10分钟。
2、吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯仿抽提,直至水相和有机相交界面无蛋白为止。
3、吸取水相于新eppendorf管,加入等体积氯仿,用手倒置离心管数十秒,4℃下12000g离心10分钟。
4、取水相,加入1/10倍体积的3mol/LNaAc(pH5.2),2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30分钟。
第六章
基因工程的主要操作原理2011-9-24基因工程基本操作*第一节DNA提取(一)总DNA的提取大肠杆菌总DNA提取植物总DNA提取动物总DNA提取质粒DNA提取噬菌体D
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