真核生物基因组DNA的提取、电泳.pptVIP

DNA提取步骤图解乙醇沉淀01SDS裂解蛋白酶K消化02琼脂糖电泳03PCR04酚氯仿抽提05二、各种试剂的作用蛋白酶K(或链霉蛋白酶)成分：N:NaCl50mME:EDTA.Na225mM(PH:8.0)作用：金属离子螯合剂，抑制DNase的活性(螯合DNase发挥活性所需的2价阳离子)。1、NE溶液：01作用：a.阴离子型去污剂，溶解细胞膜、核膜上脂质成分使蛋白质变性将细胞膜、核膜破坏；对核酸酶有抑制作用作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。2、SDS：十二烷基硫酸钠终浓度0.5%024、TE饱和重蒸苯酚：重蒸酚:酚的作用是变性蛋白质，而对DNA结构没有影响。无色酚的氧化产物(如醌等,粉红色)破坏磷酸二脂键。重蒸酚是将酚中的酚的氧化产物去除。TE溶液:Tris-HCl10mM(pH:8.0)EDTA.Na21mM(pH:8.0)作用：提供略碱的pH值，保证DNA溶于水相。在酸性条件下，DNA分配于有机相。8-羟基喹啉：0.1%黄色酚相指示剂抗氧化剂作用：去除蛋白等杂质。酚对蛋白有强烈的变性作用，可使样品中的蛋白质变性，通过离心去除。为防止其对后续实验的影响，一般再用氯仿抽提去除残留的酚。成分：氯仿的变性作用不如酚好，但与酚共同/交替使用可增强去蛋白效果；氯仿有加速有机相和水相的分离、去除植物色素和蔗糖、抑制核酸酶活性；氯仿作用：01氯仿的作用：去除DNA水溶液中残留的微量酚。异戊醇的作用：减少操作过程中气泡的产生。6、氯仿/异戊醇(24:1)025、酚/氯仿在单价阳离子存在的情况下，乙醇可以使DNA发生沉淀。8、无水乙醇：作用：提供单价阳离子。7、醋酸钠：3MNaAcpH:5.2核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，能与很多阳离子形成盐类而沉淀，在许多种有机溶剂中不溶解，也不会被变性。最常用沉淀剂为1价钠、钾、胺和锂等离子的盐类，如醋酸钠、NaCl、氯化锂、氯化钾等常用有机沉淀剂有：乙醇、异丙醇、聚乙二醇、精胺等1、加入580ul(等体积)TE饱和酚,混匀1min.10000rpm,2min。(注意抽取下层酚相;轻柔混匀，避免DNA链断裂;)实验第二部分、酚氯仿抽提DNA及乙醇沉淀5、加入2-2.5倍体积无水乙醇（1ml）混匀后置-70℃沉淀10min。4、取300ul上清至一新管中，加入1/10体积（约30ul）醋酸钠于上清中充分混匀。3、将400ul上层水相移至一新管中。加入400ul(等体积)氯仿-异戊醇，同上条件混匀后离心。2、将500ul上层水相移至一新管中，加入500ul(等体积)酚/氯仿，同上条件混匀、离心。(注意要尽量抽尽，又不可吸起酚相)。本实验将用到的TE饱和重蒸苯酚、氯仿/异戊醇是有机试剂，比水的比重大，而DNA溶解在水里，我们总是取上清。；01在抽取完苯酚、氯仿等有机试剂，不能将加样器平放或倒置，以防液体导流损坏加样器，加完样后立即弃掉加样器头。。02因组DNA由于太大，非常容易受机械剪切而断裂，因此，为了得到完整的基因组DNA，尽量不要多次进行物理性操作。03注意事项：实验设计（15分）1）实验设计方案具有创新性。2）实验设计完整、规范：内容应包括实验名称、姓名、单位、实验目的、实验方法和步骤、预期实验结果、关键问题讨论及参考文献。3）实验设计合理、实验方法适当，有可行性。********置50°C水浴50分钟讲解：能溶解入10％一l5％的水分，因溶解的水分而损失部分DNA(酚不能抑制RNAase的活性,溶解掉部分ploy(A)RNA)******要。**本次实验使用未经酶切的DNA样品电泳，由于片段大，在加样孔附近可看到一条很亮的DNA带。分子生物学实验1、欢迎大家参加分生实验的学习！2、分生实验的重要性；3、每组2人，做一份实验；4、守纪律，听老师安排，穿白衣；5、同学们