细胞免疫染色及畸胎瘤切片的制作流程.pptVIP

畸胎瘤石蜡切片的制备流程烤片机37℃烤片过夜，防止脱片展片温水槽温度设定：37-42℃左右固定包埋切片捞片、展片、烤片多能干细胞免疫染色

及畸胎瘤石蜡切片的制作流程成璐复旦大学生物医学研究院第一部分多能干细胞免疫染色过程细胞的固定观察荧光染色并拍照铺细胞细胞的荧光染色提纲铺细胞ES细胞或iPS细胞的密度要求无滋养层细胞较好传代后至克隆形态良好，密度适中。通常传至24孔板中。因为用Hochest染核对照也会将滋养层细胞的核同时染上，影响克隆定位。Oct4/DAPI1铺细胞2细胞的固定3细胞的荧光染色4观察荧光染色并拍照提纲细胞的固定材料流程把细胞固定在4％PFA中，室温放置30min4％多聚甲醛（4％PFA,Paraformaldehyde）固定细胞之前，将培养基吸弃，用PBS涮2次0.1M的PBS配制（PH7.4），100mLPBS加4克多聚甲醛。由于多聚甲醛难溶于水，需用磁力搅拌器加热搅拌，温度控制在60℃以下。1铺细胞2细胞的固定3细胞的荧光染色4观察荧光染色并拍照提纲细胞的荧光染色材料流程阳性染色对照：染色呈阴性时，证实染色的有效性阴性染色对照：染色呈阳性时，证实染色的特异性一抗、二抗、Hoechst（DAPI）：分别发挥如下作用：识别特异抗原、特异一抗及细胞核抗体稀释液：稀释抗体封闭液：封闭非特异性反应洗涤细胞透膜（仅限染核抗体）一抗孵育二抗孵育染核定位（Hochest）细胞的荧光染色材料阳性染色对照：以多能干细胞标记物染色为例，阳性染色对照细胞是确定表达相应抗体的细胞，如ES细胞或经过验证的iPS细胞阴性染色对照：是确定不表达相应抗体的细胞，如成纤维细胞等。一抗：要确保所购买的一抗识别所染细胞的物种；要做预实验以确定最适的抗体浓度二抗：要根据所染细胞自身所带的荧光类型决定相应的二抗的荧光类型，二者应不同。Hoechst：英文名称：bisBenzimide（SigmaB1155）；以PBS配制成1mg/ml的母液，分装后于-20℃保存；常用的可置于4℃，染色时以1XPBS1000倍稀释。抗体稀释液：0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于1XPBS；4℃保存；尽量现用现配，因含蛋白成分，容易变质，长菌。封闭液：含1%BSA+4%normalserum+0.4%TritonX100的1XPBS溶液；4℃保存；尽量现用现配，因含蛋白成分，容易变质，长菌。细胞的荧光染色流程所有洗涤，浸泡步骤都在摇床上进行。目的是为了洗涤，浸泡充分均匀。“洗涤”指将平板置于摇床上摇洗3－5分钟把细胞固定在4％PFA中，室温放置30min1XPBS洗涤2次抗体稀释液洗涤两次无水乙醇中浸泡两次，每次20min（或3次，10min/次）(此步仅限于核蛋白染色，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白)1XPBS洗涤1次封闭液封闭细胞，室温，1h将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温2h或4℃放置过夜(以24孔板为例，一抗的体积：200ul/孔)细胞的荧光染色流程吸弃一抗，用PBT（0.1%TritonX100inPBS）洗涤细胞3－5次将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到样品孔里，室温放置1h;(以24孔板为例，二抗的体积：200ul/孔)注意：从以下步骤开始，样品要注意避光！用PBT洗涤3次，约5min/次用PBS洗涤两次，5min/次再用4％PFA室温固定30min最后再用PBS洗涤两次，每次5minHoechst染核,室温放置5min铺细胞细胞的固定细胞的荧光染色观察荧光染色并拍照提纲观察荧光染色并拍照iPS细胞染色实例多能干细胞标记物的常用抗体：膜抗体：SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4胞浆抗体：Tra-1-60、Tra-1-81核抗体：Oct4、Nanog、Rex1h阳性对照阴性对照Rat-iPSCs观察荧光染色并拍照iPS细胞染色实例阳性对照阴性对照hhESCsTra-1-60观察荧光染色并拍照iPS细胞染色实例Pig-iPSCs观察荧光染色并拍照iPS细胞染色实例Human-iPSCsEB分化染色Sox17AFPNestin?-actinSMATuj1内胚层中胚层外胚层第二部分畸胎瘤石蜡切片的制备01畸胎瘤的获得03畸胎瘤石蜡切片的HE染色02畸胎瘤石蜡切