细胞工程第十一章、动物组织与胚胎工程.pptVIP

防止冷冻损伤在冷冻液中，可以加入冷冻保护剂，如DMSO、丙二醇、乙二醇、丙三醇、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮等。冷冻保护剂的加入，可保护细胞抵抗低温对细胞产生的损害。在胚胎冷冻过程中，还需要在稍低于溶液冰点时，强行致冷，防止溶液过冷现象的发生，这种促使溶液结冰的方法称为诱发结晶或植冰（seeding）。一般，在－3℃――7℃之间诱发结晶。现在，人们已经使用玻璃化法冷冻胚胎获得成功，在冷冻保存液中加入高浓度的冷冻保护剂，使溶液粘性增强，当处于超低温时，形成玻璃样液体。123动物胚胎的一般保存程序是将胚胎吸入含M2液的安瓿瓶中，冷却到0℃，逐渐加入冷冻保护剂，封闭安瓿。然后，把封闭好的安瓿从0℃冰室，转移到－5-－6℃的恒冷室中，用预先在液氮凹面冷却的眼科镊子尖部，接触安瓿，玻璃上一出现霜，就立即移开镊子，完成植冰过程，之后，慢速冷至－40℃或－70℃，再直接投入液氮中保存。超低温冷冻保存方法慢速冷冻、慢速解冻法是最早建立起来的哺乳动物胚胎冷冻方法。以低于1℃/分钟的速度降低到－40℃或－70℃（小鼠）、－60℃――120℃(牛)、－80℃（卵母细胞），再投入液氮。解冻速度也不超过25℃/分钟。其优点是脱水完全，细胞内不易形成冰，但比较费时，冷冻保护剂对胚胎作用时间长。快速冷冻、快速解冻法是指把胚胎慢速降温到－30――35℃，投入液氮。解冻可以在室温或37℃水浴中进行。该方法能较好地克服胚胎脱水少细胞内冰晶形成之间的矛盾，获得较高的存活率。解冻后，用蔗糖洗脱。胚胎移植的生理学基础胚胎移植的基本原则（二）胚胎移植的生理基础及原则1.胚胎移植的生理学基础1成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵数可达十数个2每个发情周期生殖器官都有一个孕向发育3早期胚胎处于游离状态4胚胎发育不存在免疫问题5胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组联系6胚胎的遗传性不受受体的影响胚胎移植前后所处的环境的同一性供体和受体在分类学上的相同属性动物生理上的一致性：受体和供体在发情时间上的同期性动物解剖位置上的一致性：空间环境的一致性胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响供体和受体的选择超数排卵处理供体母畜的配种胚胎的收集胚胎的移植胚胎的检查胚胎的保存与培养供体和受体的术后观察（三）、胚胎移植的技术程序受体健康状况良好，已进入发情季节4供受体发情时间应接近或一致5供体应具有相当高的育种价值1供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，无生殖系统疾病，体质强健2受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种31.供体和受体的选择2.超数排卵处理利用促性腺激素处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵（superovulation）意义：让每个供体提供更多的胚胎处理时间：牛：预计自然发情时间的前4天，或发情周期的第16-17天羊：发情周期的第12-15天，促性腺激素处理的第二天或第三天，注射PG同期发情与超排程序放栓发情鉴定配种012345678910111213141516171819207:00FSH4ml18:00FSH4ml7:00FSH2.5ml18:00FSH2.5ml7:00FSH2ml14:00PG6ml18:00FSH2ml7:00FSH1.5ml14:00取栓18:00FSH1.5ml配种配种检查黄体冲胚移胚母牛发情后9—13天开始肌肉注射促卵泡素(FSH)，每次剂量为50IU，每天两次，每次间隔12h，连续注射4天，共8次。在首次注射促卵泡素(FSH)后的48h、60h和72h，分别肌肉注射氯前列烯醇0.2mg。经观察，母牛在首次用氯前列烯醇后的30--60h相继出现发情。A在性周期第16天，肌肉注射孕马血清(PMSG)2500IU，在20--21天时静脉注射绒毛膜促性腺激素(HCG)2000IU；或在性周期第8-14天，肌肉注射孕马血清2000IU，48h后用前列腺素F2a33mg，一次肌肉注射。B在发情周期的第9天以后，注射PG2α（牛2.4mg,羊1.2mg)。常可在注射后60—96小时内发情。受体牛发情之日计为0天，6—8天内进行胚胎移植。前列腺素处理法：有溶黄体作用牛：于处理的第一天，注射雌二醇2mg，同时埋植孕酮或放置孕酮（200mg)阴道海绵栓，处理9~12天，取出埋植或阴道栓后2~4天内可发