血浆蛋白质醋纤膜电泳.ppt

电泳分类：自由电泳、区带电泳（按支持物不同分，按装置不同分，按pH的连续性不同分）薄膜对各种蛋白质（包括血浆白蛋白、溶酶菌及核糖核酸酶）几乎完全不吸附，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象。对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。电渗作用虽高但很均一，不影响样品分离效果。又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少。5ug的蛋白质可得到满意的分离效果。血浆蛋白质

醋酸纤维素薄膜电泳

掌握醋酸纤维素薄膜电泳的原理掌握醋酸纤维素薄膜电泳分离血浆蛋白质的实验操作技术和注意事项。了解醋酸纤维素薄膜作支持物进行电泳的优点及使用范围。实验目的采用醋酸纤维素薄膜作为支持物的电泳方法叫做醋酸纤维素薄膜电泳。醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化所形成的纤维素醋酸酯，将它溶于有机溶剂（如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜，干燥后就成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状结构，厚度约为120μm，通透性好，对分子移动阻力少，是一种良好的电泳支持物。醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳的优点及应用具有微量、快速、简便、区带清晰、灵敏度高、便于摄影和保存等优点。用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如血浆蛋白、血红蛋白、球蛋白、脂蛋白、糖蛋白、甲胎蛋白、同工酶等的分离鉴定。原理血浆中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血浆中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白，纤维蛋白原６条区带。血浆蛋白质的等电点、

平均相对分子量、及正常含量球蛋白清蛋白Aα1α2βγpI相对分子量（×104）含量（%）4.886.957~725.06202~55.06304~95.129~156.2~126.85~7.315.6~3012~20实验材料健康人血浆或动物血浆洗脱液4透明液（试剂配制参见实验讲义）5pH8.6巴比妥缓冲液1氨基黑10B染色液2漂洗液3定量时用6试剂0102常压电泳仪、电泳槽醋酸纤维素薄膜（2×8cm）点样器（载玻片或盖玻片）、玻璃板培养皿（泡膜、染色和漂洗用）滤纸镊子试管、试管架、吸量管分光光度计（定量用）仪器和器材薄膜准备将醋酸纤维素薄膜切成2×8cm的小条。在薄膜粗面一端1.5cm处用铅笔轻轻画一横线。在薄膜角上用铅笔作一标记。将醋酸纤维素薄膜浸泡于缓冲液中20min。操作步骤操作步骤醋酸纤维素薄膜规格及点样位置8cm2cm点样线点样区1.5cm(粗面）操作步骤电泳仪准备在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高。先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。0102用镊子把膜条从缓冲液中取出，夹在两层滤纸中间，吸去多余的液体，然后平铺在玻璃板上（粗面朝上），将点样器先在培养皿的血浆中沾一下，再在膜条点样线处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血浆样品。点样线尽量点得细窄而均匀。宁少勿多。点样（电泳的关键步骤）操作步骤上槽待血浆吸入膜后，以薄膜粗面向下、点样端置阴极端，两端紧贴在滤纸盐桥上，膜应轻轻拉平，加盖，平衡约5min，使薄膜渗透的缓冲液达到平衡。切勿使点样处与电泳槽接触010203操作步骤醋酸纤维素薄膜电泳装置示意图电泳1检查电泳装置是否正确，开启电源，调节电压、电流，然后通电40~60min。2电压：110~150V（10V/cm膜长）3薄膜的有效长度是两电极缓冲液面之间滤纸盐桥和薄膜的长度之和。4电流：0.4~0.6mA/cm膜宽5有数条膜便求数条膜宽的总和。6操作步骤电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。1取出膜，用滤纸吸干即可。3取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2~3次），至背景