研究生分生带教课件-余国庆.pptVIP

单个核细胞〔peripheralbloodmononuclearcells--PBMC〕

是血液中含未分叶核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞;

抑制RNA酶活性的试剂

焦磷酸二乙酯〔DEPC)：一种强烈的烷化剂，能够和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反响而以抑制外源RNA酶

异硫氰酸胍：一种强蛋白变性剂，可使包括RNA酶在内的所有酶活性丧失，抑制外源性RNA酶活性;

1、外周血单个核细胞的别离

1〕吸取2ml淋巴细胞别离液参加玻璃试管，待用

2〕取抗凝血1ml，用1ml生理盐水混匀，然后沿管壁缓慢参加淋巴别离液上层，小心放入离心机，室温，离心2000rpm，15min

3〕用塑料吸管吸去最上层的血浆，再吸取单个核细胞层于一新的离心管中，加生理盐水至管口1cm，混匀后离心，2500rpm，10min

4〕去上清，再次加生理盐水0.5ml，转入1.5ml的Ep管，2000rpm，2-5min

5〕留细胞沉淀于Ep管用于下一步的总RNA提取;

2、单个核细胞中总RNA的提取纯化：异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法

1〕在留有细胞沉淀的Ep管中一次参加500ul变性液Trzol、100ul氯仿-异丙醇〔49/1〕，置于漩涡混合器上混匀，冰浴10-15min

2〕4℃12000rpm，离心10-15min，吸取上层水相转入Ep管中，加等体积的异丙醇，-20℃，0.5h;

3〕4℃12000rpm，离心10-15min，去上层异丙醇，参加500ul70%乙醇进行洗涤。4℃12000rpm，10min，倒去70%乙醇，留沉淀真空烘干

4〕用10ulDEPC处理水溶解RNA，-20℃保存，用于逆转录;

3、逆转录--RT-PCR

1)反响体系：

25mMMgSO42ul

样品总RNA1.25ul

随机引物0.5ul

dNTP〔各10mmol/L〕0.5ul

2?beastBuffer5ul

Rnasin(20-40U/ul)0.25ul

DEPC处理水补至10ul;3、逆转录--RT-PCR

;1、去除外源RNase的干扰:操作要戴口罩，仪器用具要用0.1%DEPC水处理后灭菌；

2、PBMC提取时，参加抗凝血，并且注意参加血液的方式，离心时试管要轻拿轻放；

3、吸取单个核细胞时要注意不要吸取其它液层;2〕琼脂糖凝胶电泳：

agrosegel电泳是别离鉴定和纯化DNA分子的常用方法，不同浓度的琼脂糖胶可别离100bp-60kb的DNA片段，在琼脂糖电泳中，DNA迁移的速率不仅与其分子量的对数值成反比，即分子量越大，移动速率越慢，而且还与分子构型有关如质??开环DNA线性DNA共价闭合环状DNA

溴化乙锭〔EB〕能够嵌入

到DNA分子的碱基对中形成荧

光复合物，在紫外线激发下发

射荧光;

二、实验原理

3〕T4DNA连接酶:DNA连接酶是一种封闭DNA链上的缺口的酶，借助于ATP或NAD+水解提供的能量，催化DNA的3’-OH与5’的磷酸基团生成磷酸二酯健。T4DNA连接酶那么连接双链DNA分子的粘性末端或平端。;

二、实验原理

T4连接酶的连接作用;

二、实验原理

3〕TA克隆：利用Taq酶在延伸过程中会在DNA的末端加A的特性，使PCR扩增产物和带T尾的载体在连接酶的作用下连接起来。;三、实验步骤;实验步骤;三、实验步骤;实验步骤;四、本卷须知;实验三

感受态细胞的制备、转化、培养;一、实验目的;二、实验原理;2〕转化子蓝白斑筛选的原理:

使用的载体带有大肠杆菌的DNA短区段，含有?-半乳糖苷酶基因〔lacZ〕的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息，这个编码区中插入了一个多克隆位点，它并不破坏读框，宿主细胞携带编码?-半乳糖苷酶C端局部序列，虽然宿主和质粒的片段各自都没有酶活性，但能融为一体，形成具有活性的酶蛋白质-?-半乳糖苷酶，这种互补现象叫?互补，在生色物质X-gal和IPTG存在下形成蓝色菌落，但在外源基因插入到多克隆位点后，破坏了质粒载体?-半乳糖苷基因读框，不能编码?