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猪附红细胞体病实验室elisa法试剂盒检测血清抗体操作规程

一、试剂与材料准备

(1)在进行猪附红细胞体病ELISA法试剂盒检测血清抗体之前，首先需要准备以下试剂和材料：ELISA试剂盒、猪附红细胞体抗体阳性血清、猪附红细胞体抗体阴性血清、空白对照血清、酶标仪、微量移液器、吸头、洗板机、封口膜、封口机、加样枪、加样针、洗液、洗涤缓冲液、TMB底物溶液、终止液、显色液、蒸馏水、移液管、培养箱、试管架、反应板、吸水纸、实验记录本等。

(2)ELISA试剂盒应由正规厂家生产，并确保在有效期内使用。所有试剂和材料在使用前应仔细检查，确保无污染和损坏。阳性对照血清和阴性对照血清应分别来源于已知感染和未感染猪附红细胞体病的动物，以提供准确的阳性对照和阴性对照。实验前应对试剂进行充分混合，确保均匀。

(3)实验室环境应保持清洁、无尘、温度和湿度适宜。操作人员应穿戴实验服、手套、口罩等个人防护用品，避免交叉污染。所有使用的移液器、吸头、加样枪、加样针等一次性用品应在使用后丢弃，不得重复使用。同时，实验过程中产生的废弃物应按照实验室废弃物处理规定进行处理，确保实验室环境的卫生和安全。

二、样本处理与稀释

(1)样本处理是ELISA实验的第一步，通常涉及采集猪血清样本。采集时，应使用无菌采血管，避免血液凝固。采集后，将血清样本在室温下静置2-4小时，直至完全凝固。之后，将血清样本以3000-5000转/分钟的速度离心10-15分钟，以分离血清和血细胞。对于高脂血症的样本，离心速度和时长可能需要调整。

(2)在进行ELISA检测前，需要对血清样本进行适当的稀释。根据ELISA试剂盒的说明书，通常使用1:100或1:200的稀释比例。例如，对于1:100的稀释，取100微升血清加入900微升的洗涤缓冲液中，混匀后使用。在稀释过程中，应确保混合均匀，避免产生气泡。对于高滴度的样本，可能需要进一步稀释，以确保结果在检测范围内。

(3)在实际操作中，我们可以参考以下案例：在某猪场进行猪附红细胞体病抗体检测时，采集了100份血清样本。其中，有30份样本的原始滴度超过了试剂盒的检测上限。针对这些样本，我们采用了1:400的稀释比例进行检测。经过稀释处理后，所有样本的滴度均落在了检测范围内，从而确保了实验结果的准确性。在处理样本时，我们还注意到了样本的保存条件，确保样本在-20°C下冷冻保存，以防止样本降解。

三、ELISA实验操作步骤

(1)在准备好的反应板上，首先用洗涤缓冲液将板面彻底洗涤三次，每次洗涤后用吸水纸吸干。随后，将抗原包被试剂按照说明书要求加到各个孔中，每个孔100微升，覆盖后置于4°C下过夜，以使抗原吸附在板壁上。

(2)次日，将反应板从冰箱中取出，再次用洗涤缓冲液洗涤三次。洗涤后，加入待测血清样本，每孔100微升，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。将板密封后，在37°C下孵育1小时。

(3)孵育完成后，再次用洗涤缓冲液洗涤反应板五次，每次洗涤后吸干。随后，加入酶联抗体试剂，每孔100微升，再次密封板面，置于37°C下孵育30分钟。孵育结束后，用洗涤缓冲液洗涤板五次，最后加入TMB底物溶液，每孔100微升，避光反应10-15分钟。

四、结果判定与报告

(1)ELISA实验完成后，首先观察各孔的颜色变化。根据试剂盒说明书，将显色后的样品与阴性对照和阳性对照进行比较。如果样品孔的颜色深于阴性对照孔且低于或等于阳性对照孔，则判定为阳性结果。如果样品孔的颜色与阴性对照孔颜色相似，则判定为阴性结果。在判定过程中，应注意避免主观因素的影响，确保结果的准确性。

(2)对于阳性结果，进一步计算血清抗体滴度。将阳性对照血清进行倍比稀释，从1:100开始，每次稀释10倍，直至出现颜色反应。记录最后一次出现颜色反应的稀释倍数，即为血清抗体滴度。例如，如果最后一次出现颜色反应的稀释倍数为1:800，则血清抗体滴度为1:800。抗体滴度是评估猪附红细胞体病感染程度的重要指标。

(3)在完成ELISA实验后，应将实验结果整理成报告。报告应包括实验目的、实验方法、试剂和材料、实验步骤、结果判定、抗体滴度计算、结论等部分。报告中的结果应详细记录，包括每份血清样本的滴度、阳性率和阴性率等。此外，报告还应包含对实验过程中可能出现的问题进行分析和讨论，以及对实验结果进行总结和结论。报告的撰写应规范、清晰，便于相关人员查阅和分析。在必要时，报告还应附上原始数据、图片等，以增强报告的可信度。