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不同方法提取柳叶蜡梅挥发油成分及其抗氧化性、抑菌性的比较

柳叶蜡梅（ChimonanthussalicifoliusH.H.Hu）是中国特有的一种半常绿灌木，主要分布在浙江省中南部、安徽省南部和江西省北部等地，是少数兼具观赏性、食用性和药理活性的植物[1-2]。研究表明，柳叶蜡梅叶中含有丰富的挥发油类物质，而挥发油是柳叶蜡梅的主要药效物质基础之一，具有消炎杀菌、抗病毒、抗氧化和提高机体免疫力等功效[3-6]，具有很大的开发潜力。目前，对柳叶蜡梅挥发油的研究主要集中在成分分析[7-12]方面，对于同时使用3种方法提取柳叶蜡梅挥发油的化学成分、抗氧化和抑菌性差异的研究较少。本研究旨在利用挥发油提取器法、同时蒸馏萃取法、水蒸气蒸馏法提取柳叶蜡梅中的挥发油，并通过比较其得率、化学成分、抗氧活化和抑菌活性差异，为柳叶蜡梅的进一步研究及开发利用提供参考。

1材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料与试剂

柳叶蜡梅干叶，庆元县三禾元农业发展有限公司。大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、黑曲霉菌（Aspergillusniger）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）、蜡样芽孢杆菌（Bacilluscereus）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），杭州武洋生物科技有限公司。正己烷，分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司；无水硫酸钠、无水乙醇，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2,2-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid)diammonuimsalt，ABTS]，高纯试剂，合肥博美生物科技有限责任公司；马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基，生物试剂，广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.2仪器与设备

水蒸气发生装置，挥发油测定仪（规格5mL，精度0.1mL），四川蜀牛玻璃仪器有限公司；AL204分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HWS-26电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；同时蒸馏萃取装置，天长市康鹏实验设备有限公司；TU-1901紫外可见分光光度计（双光束），北京普析通用仪器有限责任公司；7890A-5975C气相色谱质谱联用仪，AgilentTechnologiesInc。

1.2实验方法

1.2.1柳叶蜡梅挥发油的提取方法

（1）挥发油提取器法提取柳叶蜡梅挥发油。取柳叶蜡梅干叶粉碎，过40目筛，称取100g粉末置于2L蒸馏瓶中，加入12倍量的纯水，充分浸泡混合，连接挥发油提取装置。从冷凝管上端敞口处添加纯水直到没过挥发油提取器刻度线，电热套170℃加热10h，待冷却后打开活塞收集挥发油，加入适量无水硫酸钠于收集的挥发油中以去除水分[13]，滤出无水挥发油，称重，计算挥发油得率。

（2）同时蒸馏萃取法提取柳叶蜡梅挥发油。称取100g柳叶蜡梅粉末置于2L蒸馏瓶中，加入12倍量的纯水，充分浸泡混合，将含物料的2L蒸馏瓶置于同时蒸馏萃取装置的重相一端，电热套170℃加热；量取200mL正己烷置于同时蒸馏萃取装置轻相一端，水浴50℃加热。连续提取10h后，收集萃取液，加入适量无水硫酸钠于萃取液中以去除水分，过滤，20℃减压浓缩，收集挥发油，称重，计算挥发油得率。

（3）水蒸气蒸馏提取柳叶蜡梅挥发油。称取100g柳叶蜡梅粉末置于2L蒸馏瓶中，连接至水蒸气发生装置，蒸馏提取10h。收集馏出液，用适量正己烷萃取3次，合并萃取液，20℃减压浓缩，收集挥发油，称重，计算挥发油得率。

（4）挥发油得率计算。计算提取率，提取率=柳叶蜡梅挥发油质量/柳叶蜡梅粉末总质量×100%，每种方法平行操作6次。

1.2.2GC-MS分析

（1）GC条件。进样口温度：230℃，进样量：1μL，分流比为20∶1，色谱柱：HP-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）。升温程序：初始温度为70℃，以10℃·min-1升至280℃，保持5min。

（2）MS条件。电子电离源，离子源温度150℃；溶剂延迟2min，全扫描模式，扫描质量范围为50～500amu。采用NISTMSSearch2.0数据库进行挥发性成分的定性分析。

经CA-074预处理后再加LPS刺激，相比于单纯使用LPS刺激，CA-074+LPS组小鼠的肝组织变性坏死显著减轻，肝组织膨胀明显缓解，仅有少量空泡存在。

1.2.3抗氧化活性测定

本研究选取DPPH法和ABTS