HYD_CAB(ATO)双酶复合体纳米颗粒制备及其性质研究.pdf

中文摘要

D-氨基酸是一类重要的医药中间体，需求量逐年攀升，产品单价昂贵，鉴于D-

氨基酸属于非天然氨基酸，因此无法从天然产物中提取获得。传统方法是用化学合

成法，该方法生产成本高、污染大。国外目前已经升级为生物酶法生产，生产成本

低而且环境友好，我国由于起步较晚，目前还没有完成产业升级换代。酶法制备D-

氨基酸是用两个专一性的酶进行顺序转化获得D-氨基酸，主要包括D-海因酶

（HYD）和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶（CAB）。本实验室前期通过一菌两酶

法生产D-氨基酸，但是受到了CAB的活性和稳定性的限制。同时在酶法制备D-氨

基酸时HYD活力远高于CAB活力，为了提高顺序酶催化过程的催化效率，本实验

室已经将来自于中华根瘤菌SS-ori中CAB的热稳定性、抗氧化和增溶相关氨基酸位

点突变得到突变酶CAB(ATO)。本文利用Tag/Catcher系统以及七聚体蛋白IMX313

自由调整来自假单胞菌YZ-26的HYD和CAB(ATO)双酶比例得到HYD/CAB(ATO)

双酶复合体纳米颗粒反应器，以期提高D-氨基酸的制备效率。

游离酶具有分散度高、代谢流不平衡和底物扩散效应等特点，在反应过程中容

易造成中间产物积累从而使得产量不高。很多研究者利用多种自组装技术在体内外

成功构建了很多人工多酶反应系统。然而这些组装技术仍有很多问题有待解决，如

多酶复合物容易受细胞生长环境如温度、pH和离子强度等因素的影响，导致多酶复

合体不稳定从而影响其催化效率。目前，有研究发现源于酿脓链球菌CnaB2结构域

的SpyTag/SpyCatcher体系，在各种条件如各种温度、pH与缓冲液下均能自发形成

稳定的异肽键。本文在HYD和CAB(ATO)的C端都融合SpyTag（SpT）标签、His

标签以及柔性Linker提高蛋白溶解性和活力。利用无缝克隆技术构建到大肠杆菌表

达载体上获得重组质粒。然后通过大肠杆菌表达系统诱导表达蛋白，再利用Ni-

NTA琼脂糖纯化树脂得到较纯的目标融合蛋白HYD-SpT和CAB(ATO)-SpT。检测

其活性发现HYD活力远高于CAB(ATO)活力，又有IMX313是可自组装成同源七聚

体的纳米颗粒且具有很高的稳定性，所以可以试图借助此来调整HYD与CAB(ATO)

的组装比例。本实验还利用基因重组技术在IMX313的N端和C端都通过柔性Linker

连接融合了SpyCatcher（SpC）标签，并克隆到原核表达载体上。将其转化入E.coli

BL21(DE3)并诱导表达后，目标蛋白大部分以可溶形式表达，用Ni-NTA琼脂糖纯

化树脂得到较纯的融合蛋白SpC-IMX-SpC。在上述实验基础上，将纯化的融合蛋白

I

HYD-SpT、CAB(ATO)-SpT和SpC-IMX-SpC按照[SpC-IMX-SpC]：[HYD-SpT和

CAB(ATO)-SpT]摩尔比为1：14在25℃下孵育10h，使其自组装（HYD-SpT和

CAB(ATO)活力比为1：1）。SDS分析证实了HYD/CAB(ATO)双酶复合体纳

米颗粒的组装。通过比较相同条件下HYD/CAB(ATO)双酶复合体纳米颗粒自组装

体系和游离双酶HYD/CAB(ATO)体系的活力，发现自组装体系活力相对游离体系

活力提高了133%。同时也从动力学常数、热稳定性和抗氧化性进行了分析，发现

自组装体系均比游离体系表现更佳。

关键词：D-氨基酸；HYD/CAB(ATO)；多酶复合体；SpyTag/SpyCatcher；IMX313

II

目录

中文摘要I

ABSTRACTIII

1绪论1

1.1D-氨基酸1

1.1.1D-氨基酸的性质1

1.1.2D-氨基酸的分布2

1.1.3D-氨基酸的应用4

1.1.4D-氨基酸的制备方法5

1.2D-海因