流式细胞仪的原理与应用PPT.ppt

关于流式细胞仪的原理与应用PPT第1页，共38页，星期日，2025年，2月5日一简介流式细胞仪(FlowCytometer):是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(FlowCytometry，FCM):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。第2页，共38页，星期日，2025年，2月5日流式细胞仪的特点单个细胞或微粒分析同时多参数分析速度快：10000个细胞(微粒)/秒统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分选感兴趣的细胞或微粒第3页，共38页，星期日，2025年，2月5日举例：细胞周期分布检测第4页，共38页，星期日，2025年，2月5日流路(液流系统）流动室 鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5*105~1*106个/ml光路（光学系统）光源滤片电路（检测系统）光电倍增管PMT放大电路HV及GAIN增益A/D转换统计（分析系统）计算机二构造及工作原理第5页，共38页，星期日，2025年，2月5日流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。液流系统第6页，共38页，星期日，2025年，2月5日流动室InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid液流系统第7页，共38页，星期日，2025年，2月5日激光光源：目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光(laser)是—种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光照强度。光学系统第8页，共38页，星期日，2025年，2月5日信号散射光信号FS细胞大小SS细胞颗粒性荧光信号FL1–FITCFL2–PEFL3–ECDFL4–PC5光学系统第9页，共38页，星期日，2025年，2月5日散射光信号——细胞大小及颗粒性FSSS光学系统第10页，共38页，星期日，2025年，2月5日光路（滤片特性）光学系统第11页，共38页，星期日，2025年，2月5日流式细胞仪光路图Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BPFL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL光学系统第12页，共38页，星期日，2025年，2月5日电路电压调节光电倍增管电压volts增益Gain信号放大方式检测系统第13页，共38页，星期日，2025年，2月5日电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。细胞DNA含量、RNA含量等的测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍，通常使用对数放大器。检测系统第14页，共38页，星期日，2025年，2月5日常用荧光染料介绍FITC：绿色525nmPE：橙黄色575nmECD：橙红色610nmPE－CY5：深红色675nmPerCP：