质谱分析法鉴定多形汉逊酵母Pex14p的磷酸化位点.pptVIP

质谱分析法鉴定多形汉逊酵母Pex14p的磷酸化位点Identi?cationofphosphorylationsitesinHansenulapolymorphaPex14pbymassspectrometryPex14p是过氧化物酶体膜蛋白，它既参与过氧化物酶体的增殖，也参与过氧化物酶体的选择性降解。作者之前发现，活体多形汉逊酵母中的Pex14p是以磷酸化状态存在的。0102但是，具体的磷酸化位点和生理作用尚未知道。本文通过质谱分析确定了Pex14p的具体磷酸化位点，并试图分析其在过氧化氢酶体增殖和吞噬中的作用。0102H6-Pex14p的cDNA和pHIPX4载体连接，得到pHIPX4-H6PEX14，转化Δpex14细胞。用含甲醇的培养基诱导酵母表达，培养基中仅含有32P的磷酸盐。酵母中过氧化物酶体大量增殖。随着时间增长，Pex14p中的磷酸化位点都会变成32P标记的。质谱分析从过表达酵母菌株中提取H6-Pex14p，然后进行SDS，考马斯亮蓝染色01划线部分是观测的多肽序列，带*的是磷酸化位点02通过分析质谱图得知，磷酸化位点在Thr248和Ser25803为了进一步研究磷酸化的生理作用，作者选育三种不同的突变株，分别是T248A、S258A和T248A/S258A突变体。1分别用Ala取代T248和S2582Pex14p的westernblot结果中，野生型（WT）呈现三条带推测T248A的Pex14p是因受激发而呈现三条带，具体原因尚不明确S258A和T248A/S258A突变体分别呈现两条带和一条带野生型（WT）的酵母细胞，转移到甲醇平板后，产生大量过氧化氢酶体，磷酸化的Pex14p迅速诱导产生，非磷酸化化的Pex14p迅速减少，直至24h后检测不到T248A突变体的Pex14p动态与WT的很相似S258A突变体的Pex14p动态与WT大体相似，只是直到24h还存在着非磷酸化带T248A/S258A双突变体只呈现一条非磷酸化的Pex14p条带之后转移到葡萄糖培养基中，此时过氧化物酶体被选择性吞噬。01在吞噬过程中，过氧化氢基质蛋白也被降解，如AOX。02转移到葡萄糖培养后，WT细胞中磷酸化的Pex14p因为吞噬作用在最初的0.5小时内迅速减少相比之下，非磷酸化的Pex14p呈现相对缓慢的降解速度Pex14p降解的过程中，所有的突变体表现出了相同的动力学特征去核后上清（PNS）30000g离心得到细胞器膜球团（P）和上清（S）AOX醇氧化酶，过氧化氢酶体基质蛋白AMO胺氧化酶，过氧化氢酶体基质蛋白去核后上清（PNS）30000g离心得到细胞器膜球团（P）和上清（S）AOX醇氧化酶，过氧化氢酶体基质蛋白AMO胺氧化酶，过氧化氢酶体基质蛋白在过氧化氢酶体诱导的条件下，Pex14p在Thr248和Ser258的磷酸化作用，不影响基质蛋白转运进入过氧化氢酶体。01在过氧化物酶体增殖和选择性降解过程中，与野生型相比，突变体并没有明显的表型差异。Pex14p的磷酸化位点的具体作用还有待进一步研究。02单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。您的内容已经简明扼要，字字珠玑，但信息却千丝万缕、错综复杂，需要用更多的文字来表述；但请您尽可能提炼思想的精髓，否则容易造成观者的阅读压力，适得其反。正如我们都希望改变世界，希望给别人带去光明，但更多时候我们只需要播下一颗种子，自然有微风吹拂，雨露滋养。恰如其分地表达观点，往往事半功倍。当您的内容到达这个限度时，或许已经不纯粹作用于演示，极大可能运用于阅读领域；无论是传播观点、知识分享还是汇报工作，内容的详尽固然重要，但请一定注意信息框架的清晰，这样才能使内容层次分明，页面简洁易读。如果您的内容确实非常重要又难以精简，也请使用分段处理，对内容进行简单的梳理和提炼，这样会使逻辑框架相对清晰。为了能让您有更直观的字数感受，并进一步方便使用，我们设置了文本的最大限度，当您输入的文字到这里时，已濒临页面容纳内容的上限，若还有更多内容，请酌情缩小字号，但我们不建议您的文本字号小于14磅，请您务必注意。单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。您的内容已经简明扼要，字字珠玑，但信息却千丝万缕、错综复杂，需要用更多的文字来表述；但请您尽可能提炼思想的精髓，否则容易造成观者的阅读压力，适得其反。正如我们都希望改变世界，希望给别人带去光明，但更多时候我们只需要播下一颗种子，自然有微风吹拂，雨露滋养。恰如其