猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术(DB37∕T3112-2018).pdf

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B41

猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术

2018-02-02发布

山东省质量技术监督局发布

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由山东省畜牧兽医局提出。

本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。

本标准起草人：李俊、时建立、彭喆、吴晓燕、张玲玲、郑书轩、徐绍建、孙文博、于江、丛晓燕、

韩红、吴家强、杜以军、陈蕾、陈智、刘畅。

I

猪伪狂犬病毒环介导等温扩增检测技术

1范围

isothermalamplification,LAMP)检测技术的操作步骤。

本标准适用于猪伪狂犬病毒的检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

3术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

LAMP

环介导等温扩增技术。

3.2

BstDNAPolymerase

嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶。

3.3

SDS

十二烷基硫酸钠。

3.4

4SGreenPlusNucleicAcidStain

无毒型核酸染色剂。

4材料及设备

4.1主要仪器设备

4.1.220000r/min低温高速离心机。

1

4.1.3电热恒温水槽。

4.1.4稳流稳压电泳仪。

4.1.5水平电泳槽。

4.1.6凝胶成像系统。

4.1.7紫外透射反射分析仪。

4.1.8电磁炉。

4.1.9烧杯(1000mL)。

4.1.10电子天平精度为：0.001g。

4.2主要试剂或材料

4.2.15mol/LBetaine溶液：配制见附录A.1。

4.2.2BstDNAPolymerase(8U/μL)。

4.2.3SYBRGreenI核酸染料。

4.2.40.5×TBE缓冲液：配制见附录A.2。

4.2.52??脂糖电泳液：配制见附录A.3。

4.2.64SGreenPlusNucleicAcidStain。

4.2.7DNAMarker2000。

4.2.810=S溶液：配制见附录A.4。

4.2.9超纯水：符合GB/T6682,三级。

4.2.10引物

猪伪狂犬病毒LAMP检测引物：

F3:5-ACGAGCCCCGCTTCCA-3。

B3:5-AGATGCAGGGCTCGTACA-3。

5检测步骤

5.1样品采集与处理

采集血清或淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器。

5.2样品处理

5.2.1血清直接用于DNA提取。

5.2.2淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等脏器各1g剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用生理盐水1:

5倍稀释，取悬液反复冻融3次，5000r/min离心15min,取上清液-20℃保存备用。

5.3病毒DNA的提取

水浴2h～3h。

15min。

2

min。

5.3.6弃上清液，加入1mL70??乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。

5.3.7加入20μL灭菌超纯水溶解沉淀，-20℃保存备用。

5.4环介导等温扩增(LAMP)检测步骤

5.4.1环介导等温扩增反应体系配制，按表1中1～8的循序配制。

表1环介导等温扩增反应体系(25μL)

体系组成体系含量

1