血清miR-1233对肾细胞癌诊断意义.pptVIP

ATGCGGTACCAT5’3’测序模板5’四套反应体系1--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddATP2--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddCTP3--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddGTP4--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddTTPTA5’TACGCCA5’TACGCCATGGTATACTACGCTACGCC第一套反应第二套反应ACGTATGGTACCGCATTACCATGGCGTA模板互补序列待测序列Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP与dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物直读碱基序列手工测序结果2、Maxam-Gilbert化学裂解法化学裂解法是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来测定DNA序列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE胶电泳后，可以直接读出DNA的顺序。将标记DNA分为G、A+G、C+T、C4个反应体系用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物电泳分离，得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列化学裂解法测序的原理硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。01肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。02哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。03在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。04碱基特异性化学切割反应：注意：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此G250用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用r-球蛋白质为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。银染色法此法较CBBR250灵敏100-1000倍，能检测蛋白与多肽，采用银盐对电泳条带进行染色，一类使用银铵溶液；另一类使用硝酸盐。搪瓷盘中倒入2000ml左右70%乙醇，把胶做好标记卸入乙醇中，摇床上固定15min。190ml蒸馏水中加入3.6%的NaOH4.2ml、20%AgNO33.6ml、氨水2ml混匀配成染色液。倒入染色液，染色30min。回收乙醇（可重复用3-5次），蒸馏水洗2遍，每遍2-3min，尽可能把水倒净。123654倒掉显色液，加蒸馏水停显，并洗2-3遍。200ml蒸馏水中加入1%柠檬酸钠1ml，甲醛100ul混匀配成显色液。倒入显色液显色至清晰。倒掉染色液，蒸馏水洗3遍，每遍2-3min，尽可能把水倒净。分子杂交（molecularhybridization）(一)种类1.按其分子种类划分1）DNA杂交—探针为DNA或RNA2）RNA杂交—探针为DNA或cDNA3）蛋白质免疫分析—探针为抗体核酸分子杂交技术：具有一定同源性的两条互补的核酸单链在一定的条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则退火形成双链，具有高度特异性。待测核酸序列：基因片段，基因组DNA和细胞总RNA。探针：用于检测的已知核酸片段称之为探针(probe)待测核酸序列及探针探针：为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于随后的检测。常用的标记物是放射性同位素，近年来也发展了一些非放射性标记物如地高辛、生物素等。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。地高辛(Digoxigenin,DIG))一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇（Steroid）物质，由于洋地黄植物的花和叶片在自然界中的唯一来源，因此抗DIG的抗体不会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要所以，生物素标记蛋白，可以用链霉亲和素标记的荧光或者二抗检测。生物素可以与亲和素、链霉亲和素结合非常紧密,比抗原抗体之间亲和力高几百万倍。生物素-亲合素系统(biotin-avidinsystem，BAS)蛋白质免疫分析—探针为抗体2.按样品制备过程划分1）原位杂交(insituhybridization)i.原位菌落杂交：DNA探针与菌落DNA的杂交。ii.原位噬菌斑杂交：DNA探针与噬菌斑DNA的杂交。iii.原位细胞杂交：cDNA与细胞中的RNA杂交iv.原