蛋白质聚焦层析.pptVIP

L/O/G/OL/O/G/O蛋白质聚焦层析

谷春娇

马力

任重

王聪

STEP1STEP2STEP3聚焦层析是一种操作简单、廉价的柱层析技术其流动相为多缓冲液，固定相为多缓冲交换剂利用层析过程中固定相偶联的具有两性解离功能的有机分子为配基，与流动相中某些两性物质发生等电聚焦反应而进行的一种分离方法定义01等电聚焦聚焦层析02柱层析发展优点有聚焦作用，蛋白峰尖、带狭，带宽度为0.04~0.05pH单位在柱内自动形成pH梯度，不需要pH梯度装置操作方便分辨率高4123近年来，由瑞典Pharmacia公司设计了一种新的分离技术，叫做聚焦层析(Chromatofocusing)，其产品已经实现量产以及商业化其优点如下：关键技术多缓冲液多缓冲液离子交换树脂两种材料分别作为流动相以及固定相发展了两类新材料属于两性电解质一类的缓冲液01含有多种缓冲液02用NaOH滴定的滴定曲线近似平滑的直线03该公司有Polyboffer96和Polybuffer74两种产品，即分别代表缓冲力范围为pH9-6和pH7-404多缓冲液(Polybuffer)带有碱性缓冲基团的阴离子交换树脂01把带电基团通过醚键与Sepharose6B的单糖连接的02也有两种产品：PBE94、PBE118应用范围分别是pH9-4和pH11-803但后者要与两性电解质Pharmalyte（pH8-10.5）联合使用04多缓冲液离子交换树脂(polybufferexehangers)原理聚焦层析PH梯度溶液的形成蛋白质的行为聚焦效应聚焦层析介质上偶联的多氨基多羧基的有机分子，具有相应的酸性和碱性离子交换基团在层析过程中能与溶液中某些阴离子或阳离子发生聚焦反应，聚焦在不同区域，使物质得到分离。这些基团本身所带的正负电荷与缓冲液中的氢离子和氢氧根离子作用而形成的pH梯度pH梯度溶液的形成例如，当柱中装阴离子交换剂PBE94（作固定相）时，先用起始缓冲液平衡到pH9，再用含pH6的多缓冲剂物质（作流动相）的淋洗液通过柱体这时多缓冲剂中酸性最强的组分与碱性阴离子交换对结合发生中和作用随着淋洗液的不断加人，柱内每点的pH值从高到低逐渐下降照此处理一段时间，从层析柱顶部到底部就形成了pH6-9的梯度。pH梯度溶液的形成pH梯度溶液的形成但是随着淋洗的进行，pH梯度会逐渐向下迁移，从底部流出液的pH却由9逐渐降至6，并最后恒定于此值，这时层析柱的pH梯度也就消失了蛋白质所带电荷取决于它的等电点（pI）和层析柱中的pH值当柱中的pH低于蛋白质的pI时，蛋白质带正电荷，且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动，固定相中的pH值是随着淋洗时间延长而变化的当蛋白质移动至环境pH高于其pI时，蛋白质由带正电荷变为带负电荷，并与阴离子交换剂结合321蛋白质的行为STEP3STEP2STEP1由于洗脱剂的通过，蛋白质周围的环境pH再次低于pI时，它又带正电荷，并从交换剂解吸下来随着洗脱液向柱底的迁移，上述过程将反复进行，于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来，从而达到了分离的目的不同蛋白质具有不同的等电点，它们在被离子交换剂结合以前，移动之距离是不同的，洗脱出来的先后次序是按等电点排列的蛋白质的行为01蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应02pH梯度的形成是聚焦效应的先决条件03如果一种蛋白质是加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，它将迅速地迁移到与它等电点相同的pH处04从此位置开始，其蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出聚焦效应若在此蛋白质样品被洗出前，再加人第二份同种蛋白质样品时，后者将在洗脱液的作用下以同样的速度向前移动，而不被固定相吸附，直到其迁移至近似本身等电点的环境处（即第一个样品的缓慢迁移处）然后两份样品以同样的速度迁移，最后同时从柱底洗出12聚焦效应大多数都是以交联的琼脂糖凝胶为载体，通过共价键结合将多氨基多羧基化合物偶联到琼脂糖凝胶载体上目前用的较多的层析介质是多聚缓冲液交换剂（固定相）PBE118，PBE94，前者属于偏碱性层析介质（pH8-11），后者属于中性层析介质（pH4-9）常用多缓冲剂（流动相）有Polybuffer96和Polybuffer74（分别在pH6-9和pH7-4范围内有较强缓冲能力如将他们混合在一起，则较强缓冲能力的pH范围为4-9聚焦层析的介质01缓冲液和多缓冲液交换树脂每次最大操作范围是3pH单位02若是样品的pl是已知的，只要选择对应的p