重组DNA技术与蛋白质工程.pptVIP

目的基因的获取重组DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达010203040506二、重组DNA技术基本原理以质粒为载体的DNA克隆过程化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。01基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)02cDNA文库(cDNAlibrary)03聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)04（一）目的基因的获取1.化学合成法由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合限制性内切酶重组DNA分子基因片段受体菌含重组分子的转化菌克隆载体组织或细胞染色体DNA2.基因组DNA文库限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库3.cDNA文库mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTTDNA序列是已知的，或两端已知，可以利用选择性体外扩增DNA的方法——PCR。是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。聚合酶链反应（PCR）0102模板DNA01引物024种dNTP03TaqDNA聚合酶04含Mg2+的缓冲液。05PCR的反应体系010203变性，加热至95℃，使模板DNA解开成单链；退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；延伸，温度升至72℃，DNA聚合酶以4种dNTP为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板互补的DNA新链。PCR的基本反应步骤及原理01变性0295?C03延伸0472?C05退火06Tm-5?C07Tm指的是把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度PCR反应条件PCR反应的基本原理克隆载体的选择和构建粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接外源基因与载体的连接BamHⅠ切割反应GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点的连接EcoRⅠ切割位点BglⅡ切割位点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4DNA连接酶15oC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15oC重组体载体自连目的基因自连同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。5′3′3′5′载体DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或机械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nTT(T)nT3′5′5′3′3′5′5′3′A(A)nAA(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4DNA连接酶15oC重组体人工接头(linker)连接由平端加上带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。人工接头及其应用EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠCCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠ*******基因重组与基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering第一节