遗传学13第十二章遗传工程.pptVIP

DNA连接酶DNA连接酶是重组DNA分子构建必不可少的工具酶，能催化DNA中相邻的3’–OH和5’–磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来3、反转录酶反转录酶是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶，故又称依赖于RNA的DNA聚合酶1通常用反转录酶构建cDNA文库（cDNAlibrary）2聚合酶链式反应(PCR)PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明,1993年诺贝尔化学奖PCR可对特定DNA片段进行扩增，且可用痕量DNA作模板，对DNA纯度要求也不高,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝PCR反应在一种混合液中进行，该混合液包括四种主要成分：两个引物（一般为20bp）、模板DNA、热稳定的DNA聚合酶（Taq酶，在95℃甚至更高的温度下活性稳定）和四种脱氧核苷酸。PCR反应在PCR仪上自动进行PCR反应从启动到结束称为一个循环，每个循环包括三个步骤：1）变性：95℃，DNA双链分离成单链2）退火(复性)：55℃左右，引物与单链的模板DNA序列互补结合3）延伸：72℃左右，Taq酶通过在引物的3’-OH端增加碱基的办法使引物延伸表12-2PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系循环数PCR产物拷贝数121252532102101024152153276820220104857625225302301073741824二、载体1、重组DNA技术重组DNA：指利用不同生物来源的DNA分子拼接的杂种DNA分子，是自然界中不存在的DNA分子重组DNA技术是基因克隆的关键技术，其主要步骤为：1)从细胞或组织获得DNA并纯化2)用限制酶切割DNA3)将获得的限制片段连接到载体上,形成重组DNA分子4)重组DNA导入宿主细胞，在宿主细胞内复制，产生大量相同拷贝的重组DNA分子--克隆5)克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收，纯化6)克隆的DNA可以转录和翻译，其产品可以被分离出来用于研究或商业开发。图12-5重组DNA技术流程2、载体载体：将外源基因送入受体细胞的工具载体类型：细菌质粒、噬菌体或病毒、细菌/酵母菌人工染色体BAC、YAC等载体特点：①在宿主细胞中能独立复制，即本身为复制子，有独立的复制起始位点②有限制酶切位点，允许外源基因插入且插入后随载体DNA分子一同进行复制或扩增③有选择标记，便于选择含重组DNA分子的寄主细胞④分子量小，多拷贝，易于操作⑤具有安全性等（1）细菌质粒：广泛应用于基因工程图12-6质粒PUC18的结构及多克隆位点Ti质粒及其衍生载体Ti质粒包括五个区域，1.LB与RB之间的T-DNA，这段序列整合到植物基因组中；2.质粒转移区(PT)；冠瘿碱代谢区；复制原点；毒性区。→T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。→Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。Ti质粒是约150-200kb的环状DNA分子，很难直接使用，故需对其加以改造，构建出Ti质粒的衍生载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体：双元载体(binaryvectors）如pBin19载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及α-互补显色标记共整合载体(integratedvectors)?噬菌体载体?噬菌体；?噬菌体DNA；?噬菌体DNA中间基因簇；将连接物体外包装后感染细菌，制备基因库（用于基因库构建）克隆大片段DNA的载体粘粒载体克隆外源片段的长度在15~45kb之间细菌人工染色体(BAC)上述的几种载体都不能携带大于50kb的外源DNA片段，而很多真核生物基因长度在50kb以上。细菌人工染色体载体就是为克隆更大的外源DNA片段而设计构建的图12-9细菌人工染色体载体pBAC108L及其多克隆位点。可插入达300kb左右的DNA片段酵母人工染色体（YAC）YAC载体可以插入大片段的DNA（1-2Mb），成为人类基因组计划（HGP）的一种重要