酵母表达系统.ppt

汉森酵母系统的高拷贝整合型表达载体高拷贝整合元件：A、高度重复序列：rDNA提供多个整合位点B、缺陷型标记基因：Leu2d提高选择压力C、抗性标记；neo提高选择压力第31页，共43页，星期日，2025年，2月5日关于酵母表达系统第1页，共43页，星期日，2025年，2月5日三酵母表达系统甲醇酵母表达系统酿酒酵母表达系统其它酵母表达系统第2页，共43页，星期日，2025年，2月5日（一）酿酒酵母表达系统酿酒酵母分泌系统酿酒酵母系统启动子酿酒酵母表达系统存在的问题酿酒酵母糖基化系统第3页，共43页，星期日，2025年，2月5日1、酿酒酵母启动子UASURSTATA起始位点编码序列mRNA40-120bp20-40bp100-1400bp1、转录起始位点；4、URS：上游阻遏序列2、TATA盒：富含AT；5、DAS：下游激活序列3、UAS：上游激活序列;DAS第4页，共43页，星期日，2025年，2月5日1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导：甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH磷酸甘油激酶基因PKG乙醇脱氢酶基因ADH酿酒酵母表达系统常用启动子第5页，共43页，星期日，2025年，2月5日2）半乳糖激酶启动子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、GAL1、GAL7和GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差半乳糖诱导、葡萄糖抑制第6页，共43页，星期日，2025年，2月5日2）半乳糖激酶启动子（GAL1）GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80A、将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录半乳糖诱导、葡萄糖抑制PromoterGAL10第7页，共43页，星期日，2025年，2月5日3）pho4TS-PHO5启动子A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子C、pho4TS温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达低温诱导、磷酸盐抑制第8页，共43页，星期日，2025年，2月5日酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源：性结合因子：MF-α酸性磷酸酯酶：PHO5蔗糖酶：SUC2杀手毒素因子：KIL2、酿酒酵母分泌系统第9页，共43页，星期日，2025年，2月5日*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用*信号肽结构：酿酒酵母信号肽特点正电荷区疏水区极性区Met目的蛋白信号肽剪切位点第10页，共43页，星期日，2025年，2月5日*分泌效率高*在酵母系统具有通用性*88个残基组成MF-α信号肽Met目的蛋白-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-KEX2DAPDAPDAP：STE13编码的二肽酶第11页，共43页，星期日，2025年，2月5日糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸）N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化3、酿酒酵母糖基化系统第12页，共43页，星期日，2025年，2月5日*过糖基化（超糖基化修饰）：N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活性与药代稳定性均有影响。*糖链组成O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸基团酿酒酵母糖基化特点第13页，共43页，星期日，2025年，2月5日1）表达水平普遍不高A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp）B、所采用的强启动子调控不严谨C、不能利用简单的无