遗传学经典课件第15章基因工程导论.pptVIP

目的基因的分离或制备人工合成目的基因当RNA的碱基顺序或蛋白质的氨基酸顺序已知时，用特定的仪器进行合成。目的基因分离富含G/C对的基因加热后用SI核酸酶切除单链，离心得到双链片段。易得到mRNA的基因用polyT柱分离mRNA，在反转录酶作用下合成cDNA，除去RNA，用DNA聚合酶下合成双链。并非严格意义上的基因。PCR扩增进化中DNA保守性很强，不同生物同一功能基因的顺序大部分相同，设计引物PCR扩增。目的基因的获得PCR扩增获得目的基因载体vector分子克隆的载体应具备的条件：在细菌中增殖，可以在菌株间传递，也可以转化菌株。含有酶切位点，最好是对多种限制酶都有单一切点，切点不在复制原点内。含有抗性基因（具备对重组体容易检测的选择性遗传标记）。其他包括质粒、噬菌体和病毒克隆载体，以繁殖DNA片段为目的的载体。如pBR322及其衍生质粒。01穿梭载体，既能在真核细胞中复制又能在原核细胞中复制的载体。02表达载体，用于使克隆的外源基因在宿主细胞内表达的载体。需要有强启动子和终止子；转录在诱导时进行，产生的mRNA具有AUG和SD。03分类：载体vector构建重组DNA”01共价闭合的环状双链DNA分子，大小从1kb到200kb不等，常带有特殊的基因。03松弛型复制质粒和严紧型复制质粒02含有复制子，可独立复制但依赖宿主的酶系04具有转移特性，接合型质粒（自主转移质粒）和非接合型质粒具有不相容性05基本性质质粒载体早期用天然质粒，有局限性改造改变大小引入适当的选择标记改变限制酶的切割位置增加合适的酶切位点质粒载体的构建pBR322的结构4362kb010203有HindIII、BamHI、SalI、PvuII、CalI、AvaI和EcoR1单一切点有Ampr和Tetr基因pBR322的构建噬菌体载体λ噬菌体是迄今为止研究得最为详尽的一种大肠杆菌双链DNA噬菌体。它的DNA分子两端各有由12个核苷酸组成的粘性末端，两者互补可形成COS位点(cohesive?end?site)。柯斯质粒(cosmid)是人工构建的带有粘性末端cos的一类质粒，其主要组成有质粒的复制起始区和抗药标记、一种或多种限制酶的单一切点以及λDNA的COS区小片段(约20至数百个碱基对)。01因而这类质粒兼具λ噬菌体和质粒的优越性，又具有高容量的克隆能力，容纳外源DNA的长度可达45?kb左右。02柯斯质粒载体单链DNA噬菌体载体用于植物基因转移的病毒载体质粒载体植物01病毒载体人工染色体动物02真核基因克隆的载体用于植物基因转移的病毒载体多种植物病毒经过改造后可用作载体。质粒载体Ti和Ri等动物病毒载体改造后失去毒性的动物病毒一些真核基因过于庞大不能作为单一片段克隆到噬菌体载体或质粒中1噬菌体人工染色体(p1artificial?chromosome，PAC)细菌人工染色体(bacterial?artificial?chromosome，BAC)酵母人工染色体(yeast?artificial?chromosome，YAC)02030401artificial?chromosome人工染色体以酵母作为构建人工染色体的材料，是由于其基因组很小，约为1～14mb，且其中极少内含子，没有重复序列和假基因。其基因行为和表达方式基本上与高等生物类似，如复制、重组、染色体分离等等，因而是研究真核生物分子遗传学的重要实验模型。A近年对有关酵母染色体的主要组分：着丝粒、自主复制序列(autonomously?replicating?sequence，ARS)及端粒的研究又较清楚，并被分离和克隆出来，其功能区已缩小到数百碱基对，这些对研究高等生物染色体的结构与功能也是极为有利的。B酵母人工染色体YAC基因组克隆用限制性内切酶切割整个基因组DNA，把所得的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。由此而得的克隆中每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段。这样的一套克隆便称作基因组克隆，而这些克隆中的一套基因组DNA片段则叫做基因组文库(genomic?library)。将某种生物的基因组DNA用限制性内切酶切割后分别与载体组合构建一系列重组质粒，转移到细菌中，通过细菌增殖保存基因片段，形成多个基因克隆。在得到的克隆数目多到可以把该生物的全部遗传信息都包含在内时，这些克隆的总体就称为基因组文库。基因组文库genomelibrary基因文库DNA基因文库(cDNA?library)是指以?mRNA为模