特殊毒性及其试验与评价方法 (2).ppt

TK：胸苷激酶，催化胸腺嘧啶脱氧核苷＋ATP→胸苷酸。存在嘧啶类似物5-溴脱氧尿苷时，产生异常核苷酸使细胞死亡。受试物存在时若细胞不死亡说明TK发生突变。（1）TK基因座第55页，共87页，星期日，2025年，2月5日次黄嘌呤、鸟嘌呤转磷酸核糖基酶：催化次黄嘌呤＋鸟嘌呤＋磷酸核糖焦磷酸→核苷-5’-单磷酸（NMP），补充途径。如存在碱基类似物，生成相应的NMP，掺入到DNA中可致死。加入受试物后能存活的细胞表示发生基因突变——HPRT-。（2）HPRT基因座第56页，共87页，星期日，2025年，2月5日制备细胞分裂中期相染色体标本，在光镜下可直接观察染色体的数目和形态的改变。染色体畸变试验也常称为细胞遗传学试验(cytogeneticassay)。染色体畸变试验可为体外试验，也可为体内试验，包括对体细胞和生殖细胞的分析。3.染色体畸变试验第57页，共87页，星期日，2025年，2月5日体内试验：多观察骨髓细胞，其分裂旺盛、易于获得和制备，优势在于可体现哺乳动物的代谢过程、DNA修复和药物动力学特征。但应注意受试物或其活性代谢产物有可能不易在骨髓中达到足够的浓度。第58页，共87页，星期日，2025年，2月5日体外试验：常用中国仓鼠肺细胞(CHL)，以及中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和V79等细胞系，但任何细胞系的染色体皆不稳定，不能准确地观察非整倍体，故在体外试验中，如考虑进行染色体数目观察，应当使用原代或早代细胞。第59页，共87页，星期日，2025年，2月5日2009-6-30上一内容回主目录?返回下一内容?返回上一内容下一内容回主目录第60页，共87页，星期日，2025年，2月5日试验步骤染毒：健康成年ICR小鼠，实验前24小时予环磷酰胺40mg/kg体重腹腔注射。收获细胞：处死动物前2~4h，秋水仙碱4mg/kg腹腔注射。小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸NS约5ml插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，吸管吹打骨髓团块混匀，以1500r/min离心10min，弃上清液。低渗：打散沉淀物，加入预温37℃的0.075mol/LKCl约6ml，混匀，于37℃低渗15~20min，再加固定液l~2ml混匀，立即以1000r/min离心10min，弃上清液。第61页，共87页，星期日，2025年，2月5日固定：重悬细胞，加入固定液4ml混匀，放置室温10~20min，然后1000r/min离心10min，去上清液。同样方法再固定一次，弃上清液，留约0.5ml。制片染色：使细胞悬浮，用吸管吸取细胞悬液，距预冰冻的载波片10~15Cm高处滴片，干燥，用10％Giemesa染色液染色10~20min，轻微冲洗，自然晾干。阅片计数。第62页，共87页，星期日，2025年，2月5日染色体数目改变包括：整倍体变异：原先2n的染色体变为多倍体如3n或4n等。非整倍体变异：染色体组中的个别染色体增加或减少。染色体结构改变包括：裂隙(G)、断裂(B)、碎片(F)、环形(r)、交换(E)以及复合性断裂等。小鼠和大鼠的染色体核型都为近端着丝点型。小鼠的染色体数为40条，大鼠的染色体数为42条。读片时每张标本片至少要分析100个中期分裂细胞。第63页，共87页，星期日，2025年，2月5日第64页，共87页，星期日，2025年，2月5日染色体的断片或迟滞的染色体在细胞分裂后期，由于不能进入子细胞的核中而在间期的子细胞胞浆内形成的游离团块物质，它与细胞主核着色一致，圆形或椭圆形。4、微核（micronucleus）试验第65页，共87页，星期日，2025年，2月5日第66页，共87页，星期日，2025年，2月5日第23页，共87页，星期日，2025年，2月5日②移码突变移码是DNA中增加或减少了一对或几对不等于3的倍数的碱基对所造成的突变。第24页，共87页，星期日，2025年，2月5日③整码突变指在DNA中增加或减少的碱基对为一个或几个密码子。④片断突变指基因中某些小片断核苷酸序列发生改变。这种损伤有时可跨越两个或数个基因。片断突变包括缺失、重复、重组、重排。第25页，共87页，星期日，2025年，2月5日2.染色体畸变指染色体的结构异常和数目异常，它是指遗传物质大的改变，一般可用光学显微镜检查适当细胞有丝分裂中期的染色体来发现。第26页，共87页，星期日，2025年，2月5日（1）染色体结构异常有些畸变是稳定的，可通过重复细