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一种快速测定酱油和醋中对羟基苯甲酸酯的方法

对羟基苯甲酸酯又称羟苯甲酯或尼泊金酯，因其存在酚羟基结构，可破坏细胞膜，使细胞内的蛋白质变性，抑制微生物的酶系统活性，造成微生物的新陈代谢异常，从而阻止其正常生长和繁殖，具有抑菌作用[1]；又因其晶体无色或白色、无味，不会影响产品的色泽和风味，在人体内代谢迅速、不会产生累积，所以被国际公认为安全、高效、广谱的防腐剂，在食品工业、化妆品、医药等领域得到了广泛使用。随着研究的深入，1978年，ISHIDATE等[2]研究表明对羟基苯甲酸酯可以引发染色体畸变；1998年，ROUTLEDGE等[3]发现对羟基苯甲酸酯存在雌激素活性；2002年，日本东京都卫生研究所报道，即使微量摄入对羟基苯甲酸丁酯，也会造成实验大鼠精子数量和浓度的显著下降，对雄性小鼠生殖系统造成不良影响[4]；2008年，DARBRE等[5]的研究发现，对羟基苯甲酸酯具有雌激素和抗雄激素活性，不仅会影响男性生殖功能，还有可能增加乳腺癌的发病率；2012年，SUGANDHA等[6]证实对羟基苯甲酸酯确实会增加女性患乳腺癌的风险。对羟基苯甲酸酯的激素活性被越来越多的人所重视，在食品工业中的应用也受到了一定的限制。

目前，我国要求酱油、醋中对羟基苯甲酸酯类及其钠盐（以对羟基苯甲酸计）最大使用量均为0.25g·kg-1[7]，食品中对羟基苯甲酸酯的检测方法主要有气相色谱法[8-11]、气相色谱-质谱法[12-15]、液相色谱法[16-19]、液相色谱-质谱法[20-22]、毛细管电泳法等[23]。GB5009.31—2016是目前食品中检测对羟基苯甲酸酯类的主要方法[24]，但是操作烦琐，消耗时间长、试剂用量大，不利于大批量样品的检测工作。本文研究建立了测定酱油、醋中对羟基苯甲酸酯类样品前处理方法，该方法前处理工作操作简单，检测结果准确可靠，在实验室检测中既能提高工作效率，又可减少试剂用量，适宜大批量样品的检测工作。同时，本文的研究内容也对其他品类样品的前处理方法具有指导意义。

1材料与方法

1.1材料与试剂

4种对羟基苯甲酸酯类混合标准溶液（1000mg·L-1）：购自国家标物中心；乙酸乙酯：HPLC级，德国Merk公司；NaCl、NaHCO3：均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水均为Millipore现制水。

1.2仪器与设备

7890B气相色谱仪：美国Agilent；MultiReax涡旋振荡器：德国Heidolph；3-18KS高速冷冻离心机：美国Sigma；电子天平：美国Ohaus。

1.3方法

1.3.1溶液配制

饱和NaCl的饱和NaHCO3溶液：在饱和NaHCO3溶液中加入NaCl至过饱和。

饱和NaHCO3的饱和NaCl溶液：在饱和NaCl溶液中加入NaHCO3至过饱和。

1.3.2样品前处理

称取5g（精确至0.001g）均匀样品于50mL离心管中，加入10mL乙酸乙酯，振摇3min后，5000r·min-1离心5min，取上清液于新的50mL离心管中，加入10mL饱和NaCl的饱和NaHCO3溶液，振摇3min后，5000r·min-1离心5min，取5mL上清液，氮吹至近干，加1mL乙醇复溶，过0.22μm有机滤膜，待测。

1.3.3色谱条件

色谱柱：HP-5（美国Agilent，30m×0.32mm，0.25μm）；载气：氮气；恒流模式：2mL·min-1。

进样口温度：250℃；进样模式：不分流；进样体积：1μL。

程序升温：100℃保持1min；20℃·min-1升温至170℃；12℃·min-1升温至220℃，保持1min；10℃·min-1升温至250℃，保持8min。

FID检测器温度：280℃；空气流速：450mL·min-1；氢气流速：40mL·min-1。

2结果与分析

2.1盐酸酸化步骤的去除

在样品前处理过程中加入1∶1盐酸1mL对样品进行酸化，可以将对羟基苯甲酸的钠盐酸化为对羟基苯甲酸，但是对羟基苯甲酸的沸点为336.2℃，不易被汽化，需经甲酯化后方能使用气相色谱法进行测定[10]。若不进行甲酯化，由于对羟基苯甲酸的酸度比碳酸强，使用饱和碳酸氢钠洗涤样液时，样液中的对羟基苯甲酸会与碳酸氢钠反应再次生成对羟基苯甲酸钠盐，因此原方法中加入1∶1盐酸1mL对样品进行酸化，对检测结果无影响。本文使用含有对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯的酱油样品就是否需要酸化样品进行了6个平行样的对比，结果如表1所示。在样品前处理过程中加入1∶1盐酸对样品酸化和不进行酸化，测定结果无显著差异。另外，考