代谢控制发酵的基本思想.pptVIP

儘管一些微生物能夠積累丙酮酸，但其產量無法達到工業生產要求而選育高產丙酮酸菌株十分困難，發酵法生產丙酮酸真正取得突破是1988年，日本東麗工業株式會社的研究人員宮田令子和米原撤選育出一系列丙酮酸產量超過50g/mL的球擬酵母菌株，使得發酵法生產丙酮酸的工業化成為可能。1989年實現工業化發酵生產，其產酸率最高達67.8g/L。1992年日本開始採用發酵法生產丙酮酸產量為400噸/年,售價為4000日元/Kg。（二）酵母代謝控制發酵生產丙酮酸Ⅰ、丙酮酸脫羧酶（PDC）；Ⅱ、丙酮酸轉氨酶（PT）；Ⅲ、丙酮酸羧化酶（PC）；Ⅳ、丙酮酸脫氫酶複合體（PDH）。NA和B1是丙酮酸脫氫酶系（PDH）的輔因數Bio是丙酮酸羧化酶（PC）的輔因數B6是丙酮酸轉氨酶（PT）的輔因數B1是丙酮酸脫羧酶（PDC）輔助因數二、D-核糖代謝控制發酵（一）D-核糖發酵機制（二）D-核糖發酵的代謝控制育種1、出發菌株選擇芽孢桿菌屬的細菌轉酮酸缺陷突變株積累D-核糖具有普遍性。而Ecoli屬傷寒沙門氏等細菌的轉酮酸缺陷突變株並不積累核糖，都採用芽孢桿菌屬細菌。2、轉酮酶缺陷突變株的分離（選育）（1）選育不利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖的突變株，因為D-葡萄糖酸和L-阿拉伯糖必須通過磷酸戌糖途徑進行代謝，若轉酮酶發生缺陷，那樣菌體自然也就不能利用D-葡萄糖酸或L-阿拉伯糖。（2）選育莽草酸缺陷突變株（3）選育L-色氨酸-、L-酪氨酸-、L-phe-、CoQ-、Vk-或葉酸缺陷突變、莽草酸缺陷、4-赤蘚糖合成受阻、轉酮酶-、轉醛酶-。3、其他標記在維持轉酮酶缺陷的情況下，進一步誘變使菌體帶上具有高葡萄糖脫氫酶活性和喪失孢子形成能力，可使D-核糖大量積累。葡萄糖脫氫酶是芽孢桿菌屬序細菌的孢子所特有的酶，該酶由於NAD、NADP和NADH2、NADPH2會發生分子型的變換，結果在菌體對生長期被誘導，導致D-核糖大量積累，若生孢子D-核糖減少。4、利用基因工程日本岩木盾等人首先將枯草桿菌染色體DNA中的轉酮酶基因克隆到載體質粒PUB110中，然後將氯黴素醯基轉移酶基因插入到轉酮酶基因之中，造成轉酮酶基因的不可逆失活。經限制性內切酶Smal切後得到線狀重組質粒，將該線狀重組質粒轉化到枯草桿菌宿主菌中，構建轉酮酶失活的D-核糖工程菌株。其核糖產量達52g/L。小林等人將葡萄糖脫氫酶基因克隆到載體質粒PHY300PLK中，然後轉化到枯草芽孢桿菌中去。構建擴增葡萄糖脫氫酶的D-核糖工程菌，350C發酵80h可積累49g/LD-核糖。5、發酵控制發酵培養基：碳源：葡萄糖、D-甘露糖、山梨醇、D-甘露醇、麥芽糖、乳糖、甘油、糊精、可溶性澱粉等。氮源：幹酵母、酵母膏、牛肉膏、蛋白腖、玉米漿、（NH4）2SO4、CaCO3。要在好氣條件下，pH中性，溫度370C。三、r-亞麻酸代謝控制發酵（一）絲狀真菌利用葡萄糖生物合成

r-亞麻酸的代謝途徑(二)高產r-亞麻酸菌株的選育思路圖3-9高產r-亞麻酸菌株的選育思路1、出發菌株多採用被孢黴（Mortierella）毛黴（Mucor）紅酵母（Rhodotorula）小克銀漢黴（Cunninghamella）等產油脂高的真菌作出發菌株。2、切斷或減弱支路代a-亞麻酸-、花生四烯酸-、二十碳五烯酸-花生四烯酸L、二十碳五烯酸L3、解除回饋調節選育脂肪酸結構類似物，如（LTBr），耐高濃度的r-亞麻酸突變株。4、強化能量代謝提高菌體細胞內ATP的水準有利於脂肪酸合成。選育呼吸抑制劑（丙二酸、氰化鉀、亞伸酸等）抗性突變株。選育ADP磷酸化抑制劑（羥胺、2.4二硝基酚等）抗性突變株。選育抑制能量代謝的抗生素(寡黴素、結元氨黴素、制黴素)抗性突變株。5、增加前體菌體生物合成γ-亞麻酸與HMP、EMP途徑直接相關。增加HMP途徑，NADPH的數量增多，有利於γ-亞麻酸產量的提高。過量的磷酸鹽或通氣不足會使EMP途徑增強。而產生NADPH的HMP途徑受阻，導致不飽和脂肪酸的合成降低。通過選育單氟乙酸敏感、碘乙酸敏感、萘啶酮酸敏感突變株，均有助於γ-亞麻酸產量的提高。另據報導，選育異檸檬酸脫氫酶滲漏突變殊，也有利於γ-亞麻酸產量的提高。6、選育△-6脫氫酶活力強的突變株△-6脫氫酶是生物合成r-亞麻酸關鍵酶之一。其活性高低直接與r-亞麻酸含量的高低密切有關，可採用選育呼吸缺陷型相反的方法，即呼吸增強型，通過誘變後菌株塗在含有TTC的一種無色的氧化還原劑的生長培養基上，若△-6脫氫酶強，即可將TTC還原成紅色的物質