《基因的克隆方法》课件 .ppt

基因的克隆方法：从理论到实践本课件将深入探讨基因克隆技术，从基本原理到实际操作，并涵盖其在生物学研究和医学领域的广泛应用。我们将学习基因克隆的各个步骤，并重点关注必威体育精装版的克隆技术发展。欢迎大家积极提问，共同探索这一激动人心的领域。

课程目标与学习重点目标了解基因克隆的基本原理和技术步骤。掌握常用的基因克隆方法和技术。认识基因克隆技术的应用领域和意义。重点目的基因的获取、克隆载体的选择和构建。DNA连接反应、转化技术和阳性克隆的筛选。克隆效率优化技巧和克隆产物的应用。

基因克隆的定义与意义基因克隆是指将特定的基因片段从供体生物体中分离出来，并将其插入载体分子中，再将载体分子导入受体生物体，使目的基因在受体细胞中大量复制和表达。基因克隆技术具有重要的意义，它为研究基因的功能、表达调控和进化提供了有力工具。该技术在生物制药、农业育种、疾病诊断和基因治疗等方面也有着广泛的应用。

基因克隆技术发展历史11970s限制性内切酶和DNA连接酶的发现为基因克隆技术奠定了基础。21973年第一个重组DNA分子被成功构建。31977年第一个基因克隆成功。41980sPCR技术问世，极大提高了基因克隆效率。51990s基因组学的发展，推动了基因克隆技术在生物学研究中的广泛应用。

基因克隆的基本原理目的基因获取从供体生物体中分离出目的基因，例如利用限制性内切酶消化法或PCR扩增法。载体选择选择合适的载体分子，如质粒、噬菌体或酵母人工染色体，用于携带目的基因。连接反应将目的基因片段连接到载体分子上，形成重组DNA分子。转化将重组DNA分子导入受体细胞，例如细菌或酵母菌。筛选筛选出含有目的基因的重组细胞，并进行克隆。

基因克隆的主要应用领域生物制药生产胰岛素、干扰素等治疗药物，开发基因工程疫苗。农业育种培育抗虫、抗病、高产作物，提高农作物产量和品质。疾病诊断开发新的疾病诊断方法，例如基因芯片技术。基因治疗利用基因克隆技术治疗遗传性疾病和某些肿瘤疾病。环境保护开发环境监测和污染治理技术，例如生物降解技术。

基因克隆实验室安全须知操作时必须穿戴实验服、手套和防护眼镜，防止污染。严格按照操作规程进行实验，防止生物危害，避免实验材料泄露。保持实验环境清洁卫生，使用无菌操作，避免细菌污染。实验废弃物要妥善处理，避免污染环境。

基因克隆的基本步骤概述目的基因获取利用限制性内切酶消化法或PCR扩增法从供体生物体中分离出目的基因。1载体选择选择合适的载体分子，如质粒、噬菌体或酵母人工染色体。2连接反应将目的基因片段连接到载体分子上，形成重组DNA分子。3转化将重组DNA分子导入受体细胞。4筛选筛选出含有目的基因的重组细胞。5

目的基因的获取方法1限制性内切酶消化法利用限制性内切酶切割供体DNA和载体DNA，产生相同的黏性末端，然后用DNA连接酶连接起来。2PCR扩增法利用PCR技术扩增目的基因片段，在引物中添加酶切位点，方便与载体连接。3文库筛选法构建基因文库，筛选含有目的基因的克隆。4化学合成法直接化学合成短的DNA片段，用于构建基因或修饰基因序列。

限制性内切酶消化法原理识别序列限制性内切酶识别特定的DNA序列，通常是4-8个碱基对的回文序列。切割DNA在识别位点或其附近切割DNA双链，产生黏性末端或平末端。酶切反应在特定的缓冲液中，加入限制性内切酶和DNA，在最佳温度下进行酶切反应。

限制性内切酶的种类与选择EcoRI识别序列：GAATTC，产生黏性末端。BamHI识别序列：GGATCC，产生黏性末端。HindIII识别序列：AAGCTT，产生黏性末端。SmaI识别序列：CCCGGG，产生平末端。

PCR扩增法概述1变性高温将DNA双链解开，使引物能够与模板DNA结合。2退火温度降低，引物与模板DNA互补配对，形成引物-模板杂交体。3延伸DNA聚合酶以引物为起点，沿着模板DNA链合成新的DNA片段。

PCR引物设计要点1长度引物长度一般为15-30个碱基对，过短或过长都会影响扩增效率。2GC含量引物GC含量一般为40%-60%，避免过高或过低，影响退火温度和特异性。3特异性引物要与模板DNA特异性结合，避免与其他序列发生非特异性结合。4二级结构避免引物自身或引物之间形成二级结构，影响退火效率。

PCR反应条件优化1退火温度根据引物序列和GC含量选择合适的退火温度，确保引物与模板DNA特异性结合。2Mg2+浓度Mg2+浓度影响DNA聚合酶的活性，需要优化浓度，提高扩增效率。3循环次数根据目的基因大小和模板DNA浓度选择合适的循环次数，避免过少或过多。

RT-PCR方法与应用

文库筛选法简介文库筛选法是将目的基因从基因文库中筛选出来的常用方法。文库筛选法利用了载体分子在受体细胞中复制的特点，将大量的目的基因片段插入载体分子中，然后在受体细胞中表达和筛选。

cDNA文库构