《基因的利器：工具酶》课件.ppt

基因编辑的利器：工具酶本课件将带您深入了解基因编辑技术的核心——工具酶，探索它们如何改变我们的世界。

课程大纲与学习目标课程大纲-基因编辑技术发展史-基因编辑工具的分类-核酸酶家族-CRISPR-Cas9系统-碱基编辑器-PrimeEditor-基因编辑工具的比较-基因编辑的应用领域-基因编辑的安全性学习目标-掌握基因编辑工具酶的基本原理-了解不同基因编辑技术的优缺点-认识基因编辑技术的应用前景和面临的挑战

基因编辑技术发展史11970s限制性内切酶的发现21980s基因工程技术的发展31990s锌指核酸酶技术的出现42000sTALEN技术的诞生52010sCRISPR-Cas9系统的突破62020s碱基编辑器、PrimeEditor

基因编辑工具的分类1第一代限制性内切酶2第二代锌指核酸酶（ZFN）3第三代转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）4第四代成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）系统5第五代碱基编辑器6第六代PrimeEditor

DNA识别系统概述识别特异性基因编辑工具酶必须能够准确地识别目标基因序列，这是它们实现精准编辑的基础。识别机制不同的工具酶利用不同的蛋白质结构和识别机制来识别目标DNA序列，例如锌指蛋白、TAL蛋白、Cas蛋白等。

DNA切割系统概述切割活性基因编辑工具酶需要具有切割DNA的能力，以在目标位点产生双链断裂（DSB）。切割机制大部分工具酶利用核酸酶活性来切割DNA，这些核酸酶通常是内切酶，可以特异性地切割特定序列。

第一代核酸酶：限制性内切酶发现时间1970年代来源细菌作用机制识别特定的DNA序列并切割该序列。应用领域基因克隆、基因诊断

限制性内切酶的作用机制识别限制性内切酶识别DNA上的特定核苷酸序列。结合酶与识别序列结合，形成稳定的复合物。切割酶催化DNA双链的断裂，产生特定的末端。

限制性内切酶的应用局限识别序列有限识别序列通常为4-8个碱基，限制了其应用范围。切割位置不可控无法精确地控制切割位置，导致基因编辑效率低下。

第二代核酸酶：锌指核酸酶1特点可编程性2应用基因敲除、基因插入

锌指核酸酶的结构特征锌指结构域每个锌指结构域识别3个碱基对。核酸酶结构域负责切割DNA双链。

锌指核酸酶的作用机制识别锌指结构域识别目标DNA序列。结合锌指核酸酶与目标DNA序列结合。切割核酸酶结构域切割DNA双链。

锌指核酸酶的优缺点优点可靶向几乎任何DNA序列。缺点设计和构建复杂，效率较低。

第三代核酸酶：TALEN1特点设计灵活，效率较高。2应用基因治疗、农业育种

TALEN的分子结构TAL结构域每个TAL结构域识别一个碱基对。核酸酶结构域负责切割DNA双链。

TALEN的作用原理识别TAL结构域识别目标DNA序列。结合TALEN与目标DNA序列结合。切割核酸酶结构域切割DNA双链。

TALEN的应用特点高效率与ZFN相比，TALEN的编辑效率更高。可靶向性强可靶向更广泛的DNA序列。

CRISPR-Cas9系统简介起源源于细菌和古细菌的免疫防御系统。关键组件-Cas9蛋白-单链引导RNA(sgRNA)

Cas9蛋白的结构识别结构域识别sgRNA和PAM序列。切割结构域负责切割DNA双链。

sgRNA的设计原理靶向序列sgRNA的20个核苷酸序列与目标DNA序列互补配对。PAM序列sgRNA需要识别PAM序列，才能启动Cas9的切割活性。

PAM序列的重要性识别关键PAM序列是Cas9蛋白识别和切割目标DNA序列的关键因素。切割启动Cas9蛋白仅在识别到PAM序列后才能切割DNA。

Cas9的作用机制识别sgRNA识别目标DNA序列和PAM序列。结合Cas9蛋白与sgRNA-DNA复合物结合。切割Cas9蛋白切割目标DNA序列。

双链断裂修复机制同源重组修复（HR）利用同源染色体作为模板修复断裂的DNA。非同源末端连接修复（NHEJ）直接连接断裂的DNA末端，可能导致插入或缺失突变。

同源重组修复精确修复HR可以实现精确的基因编辑，不会引入新的突变。细胞周期依赖性HR通常发生在细胞周期的S期和G2期。

非同源末端连接修复随机修复NHEJ修复过程随机，可能引入插入或缺失突变。高效修复NHEJ是细胞中最常见的DSB修复方式。

dCas9的特点与应用特点没有核酸酶活性，只能结合DNA。应用基因调控、基因成像

dCas9介导的基因调控基因激活dCas9融合转录激活结构域，可以激活基因表达。基因抑制dCas9融合转录抑制结构域，可以抑制基因表达。

CRISPRa和CRISPRi系统CRISPRadCas9融合转录激活结构域，用于激活基因表达。CRISPRidCas9融合转录抑制结构域，用于抑制基因表达。

碱基编辑器概述1特点无需产生双链断裂，直接改变单个碱基。2