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食品微生物检验方法的技术验证

方法技术验证是实验室在使用新标准进行检验前或在用标准实质性变更时，用以证实能够正确运用这些方法的技术性验证过程，是实验室质量管理体系中至关重要的一环[1-3]。检验检测机构通过方法验证，可以对方法的适用性进行评价，以确保检验数据准确可靠。运用不经验证的新方法进行食品检验工作，会对结果造成严重影响，轻则发生数据偏差，重则对产品判定结果造成影响[4]。

目前，仍有很多检验检测机构对食品微生物检验方法的技术验证缺乏认识，引用新标准时，仅通过对标准的培训、人员能力评价，对照评价设备、培养基、试剂、环境等是否符合标准要求来评价该标准的适用性，缺乏技术性验证过程[5-6]。本文以《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》（GB4789.7—2013）方法验证为例，根据标准适用范围及副溶血性弧菌污染海产品的特性，结合《食品安全国家标准预包装食品中致病菌限量》（GB29921—2021）[7]及《食品安全国家标准散装即食食品中致病菌限量》（GB31607—2021）[8]要求，选择水产制品和水产调味品两种基质[9-11]作为分析样本，阐述微生物检验方法技术验证全过程，从食品微生物检验方法验证技术参数、要素的控制，探讨微生物检验方法验证工作程序，结合实例，建立食品微生物检验方法技术验证基本模式，为食品检验检测机构提供借鉴和参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

选取水产制品和水产调味品海鱼和耗油作为样品基质，样品称量后加入副溶血性弧菌（编号ATCC17802，第2代工作用菌种）菌悬液，按标准要求加入稀释液，用拍击式均质器拍击2min制备样品匀液。

3%氯化钠碱性蛋白胨水、TCBS平板、弧菌显色培养基、3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂、氧化酶试剂、革兰氏染色剂和干制生化鉴定试剂盒，均由北京陆桥技术有限责任公司提供。

1.2仪器与设备

T500电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）、PREVIColorGram全自动革兰氏染色仪（法国梅里埃公司）、1mL/10mL移液器（德国普兰德公司）、BD115培养箱（德国BINDER公司）、HBM-400C样品均质器（天津恒奥科技发展有限公司）及数显温湿度计（德国testo公司）。

1.3实验与方法

根据定性检验和定量检测要求的不同，选择方法验证需要控制的验证要素。定性检验，对方法的检出水平LOD50进行验证；定量检测，从估计偏差、精密度、不确定度评定3方面进行验证。实验定性检验、定量检测流程参考《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》（GB4789.7—2013）[12]。

2结果与分析

2.1定性检验

因没有方法的确认资料，估计LOD50≤3CFU/测试单元。取副溶血性弧菌标准菌种制备0.5麦氏浊度菌液，稀释至10-7，每个稀释度菌液各取1mL至两个培养皿，加入3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃培养48h后计数，得到10-6培养皿上菌落数为19CFU，按高（10×LOD50）、中（5×LOD50）、低（1×LOD50），3个接种水平接种量应为30CFU、15CFU、3CFU，制备8个样品后，两个高接种水平样品中加入1.5mL稀释度10-6菌液，两个中接种水平样品中加入0.75mL稀释度10-6菌液，两个低接种水平样品中加入0.15mL稀释度10-6菌液，剩余两个为空白样品。加入标准菌种后，按GB4789.7—2013标准要求进行定性检验。参考《微生物检测方法确认与验证指南》（RB/T033—2020）要求，根据不同污染水平阳性结果估计LOD50，结果如表1所示。

表1副溶血性弧菌定性检出水平检测结果表

2.2定量检测

2.2.1估计偏差

本次验证针对水产制品和水产调味品两种基质中副溶血性弧菌进行定量检测。每种基质选择3个不同生产企业的不同产品，因所选产品中未检出目标菌，故进行人工污染。3个产品称样后分别添加10-2、10-3、10-4共3个稀释度的菌液0.1mL，按照GB4789.7—2013标准要求进行检验。同时，每个稀释度各取0.1mL至两个培养皿，加入3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板，36℃培养48h后计数，得到10-4培养皿上菌落数为205CFU、197CFU，样品取样量为25g，即加入样品后样品中含有副溶血性弧菌量分别为800CFU·g-1、80CFU·g-1、8CFU·g-1。计算检测结果与加入量的差值（表2），结果与对照结果之差在0.5lgCFU·g-1以内，估计偏差符合要求。

表2副溶血性弧菌定量检测估计偏差检测结果表

2.2.2精密度

水产制品和水产调味品两种基质各取10个样品，称量后各加入1