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疾病的基因治疗

复旦大学遗传学研究所

薛京伦

，10;?基因治疗几种发展时期

1980-1989 准备期 技术、宗教，伦理，法律

1990-1995 狂热期 公众，媒体

1996-至今 理性期 出现临床成果 ;人体基因治疗是一种多环节的复杂过程

基因导入靶器官、靶组织、靶细胞间的交流

基因体现水平和时空调控

基因体现产物生物活性

载体安全性

还存在许多困惑和问题;初期期望值过高，目前理论研究和技术的发展水平均还不能满足成功临床试验的需要，安全性问题还一直没有彻底处理。然而，目前对许多疾病分子机制和对基因载体的研究获得了长足的进步，为基因治疗较大范围临床试验开展打下了坚实的基础。;选择

在治疗上合适的基因——已知其在某特定疾病中的病理、生理作用

合适的基因导入系统——病毒或非病毒载体

临床前试验的有效性和安全性评价

临床试验的有效性检测手段;一、基因治疗重要病种：

重要为对人类健康威胁严重的疾病。包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如AIDS、类风湿等）。;ADA缺乏症被选为第一种基因治疗试验有如下几点原因：

单基因遗传病，功能清晰，基因小

基因调控简朴，只要“启动”状态

ADA酶量无需精确调控：很少许的酶也可使患者受益，酶量诸多也能耐受。;2、血友病B基因治疗的实践与发展

血友病B（HemophiliaB）是一种由于凝血因子IX基因（hFIX）发生突变而引起的出血性疾病。其症状体现为自发性出血，严重者可因关节出血导致关节变形和残废甚至死亡。该病为X染色体连锁，在男性中发病率大概为1/100,000。;血友病目前的临床治疗措施：

蛋白替代法：输血、输凝血酶原、注射重组FVIII，FIX，能有效地改善出血症状和延长生命，不过昂贵，且存在感染HIV，HBV（乙肝），HCV（丙肝）风险;蛋白替代法可导致克制物产生，从而使治疗失效

血友病A有10-40%的人群产生克制物

血友病B有5%的人群产生克制物

这也是我们把治疗的目光投在比蛋白替代法也许更优越的基因治疗的原因之一！;血友病是目前SGT最有但愿到达

理想疗效的遗传病???种

现行血友病B治疗手段、效果不理想

单基因遗传病

不需要精确的体现调控，无需所有细胞体现

体现广谱

理想的动物模型（二个狗品系，3个小鼠品系）

疗效易于评价

血友病A：100-200ng/ml

血友病B:5000ng/ml;;尽管人体天然的FVIII和FIX都是由肝细胞产生的。然而，试验证明，由非肝细胞如CHO产生的重组凝血因子与人体天然的凝血因子在活性和免疫原性上没有差异，到目前为止没有发现非肝细胞产生的凝血因子有不一样寻常的翻译后修饰。

因此，肝细胞不一定是血友病基因治疗必然的靶细胞。;

1）1991年，复旦大学反转录病毒介导的exvivo途径临床试验获得了安全有效的成果;反转录病毒载体;;;;2），以AAV-2/hFIX介导的直接肌肉注射，基因治疗血友病B方案已被同意临床试验（国家药物监督管理局药物临床批件，L00403）;;TransientExpressionofpAAV-hFIXs

inCellLines;InvitroExpressionofAAV/mFIX;ExpressionofrAAV-hFIXR338AinMice:;ExpressionofmFIXinHemophiliaBMouse;血友病小鼠经rAAV基因治疗后,FIX凝血活性提高,出血症状改善;3.240ulAPTT20

;采用Westerndot-blot分析表明，于肌肉注射rAAV/hFIX病毒子后第15天，小鼠血液中即开始出现抗hFIX抗体，血浆中hFIX水平亦开始下降.

经Bethesda分析,未发现抗小鼠IX因子抗体.

;肌注FIX后，抗体在7天后开始明显增长，15天时到达最高，约为正常对照的8倍左右，到60天时抗体的量开始减少，为正常对照的5倍，此后到120天，抗体的量基本不变。;建立了复制型AAV病毒检测的巢式PCR措施以及HSV病毒检测措施,提高了敏捷度。

研究了肌肉注射重组AAV在体内的分布，分散程度与注射剂量成比例，重要分布在注射肌肉组织,通过半定量PCR发现肌肉中的载体数是其他组织的1,000－10,000倍。

鼠类使用AAV毒性研究,病毒注射后血浆没有发现血清肌氨酸激酶水平的上升，体重没有变化，未见血清的化学参数或血液参数的变化。仅发现少许由淋巴细胞浸润导致的感染,无构造变化。;以高剂量AAV病毒肌肉注射老鼠试验中，未引起组织毒性,所有动物脾大小正常，未发现囊泡区的增