细胞工程单克隆抗体.ppt

第1页，共36页，星期日，2025年，2月5日一、何谓单克隆抗体？第2页，共36页，星期日，2025年，2月5日第3页，共36页，星期日，2025年，2月5日第4页，共36页，星期日，2025年，2月5日第5页，共36页，星期日，2025年，2月5日只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。第6页，共36页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myelomacell)与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridomacell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridomatechnology）。第7页，共36页，星期日，2025年，2月5日NielsK.JerneG.KohlerC.Milstein第8页，共36页，星期日，2025年，2月5日1975年，英国剑桥大学学者Kohler和Milstein将小鼠骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫后的小鼠脾细胞进行融合，形成既能产生抗绵羊红细胞抗体、又能进行分裂繁殖的杂交瘤细胞，创立了杂交瘤抗体技术，获1984年Nobel奖。1984年通过基因工程技术，初次建立了人-鼠杂交瘤。1987年单抗制剂开始用于临床试验。单抗技术，解决了抗体不纯的问题，标志着抗体制备从机体水平进入了细胞水平。由此而建立的单链抗体库技术和噬菌体抗体库技术等，则使抗体制备技术迈进分子水平。一、原理与概念第9页，共36页，星期日，2025年，2月5日杂交瘤技术基本原理哺乳动物的免疫系统包括体液免疫和细胞免疫，参与这两种免疫反应的细胞有：B淋巴细胞和T淋巴细胞。B淋巴细胞，进一步发育成浆细胞，浆细胞能产生抗体，抗体参与体液免疫。T淋巴细胞，进一步发育成吞噬细胞，直接参与细胞免疫。T细胞不能产生抗体，但可以帮助B细胞产生抗体。正常的B淋巴细胞不能在体外培养条件下长期生存，因而不能在体外持续产生抗体。而骨髓瘤细胞可以在体外快速生长，但不能分泌抗体。第10页，共36页，星期日，2025年，2月5日克隆选择学说作为抗体生成理论的克隆选择学说是杂交瘤技术产生的理论依据，细胞融合技术和杂交细胞的选择方法是杂交瘤技术产生的技术基础。克隆选择学说1957年Burnet提出的克隆选择学说认为：每一个B淋巴细胞有一个独特的受体(现在认为一个B淋巴细胞有结构相同的10万个受体)，抗原进入机体后只刺激具有相应受体的B淋巴细胞，产生与受体特异性相同的抗体分子。一个淋巴细胞只产生一种抗体分子。因此，根据克隆选择学说，一个B淋巴细胞克隆只能产生一种抗体分子。这就是生产单克隆抗体的理论依据。第11页，共36页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体与多克隆抗体单克隆抗体与多克隆抗体的本质区别单克隆抗体是源于一个B淋巴细胞的杂交瘤细胞系所分泌的针对抗原的同一表位的抗体；而多克隆抗体(简称多抗)是由免疫动物的无数不同的B淋巴细胞分泌的针对抗原不同表位的性质各异的混合抗体。单抗是同质的，多抗是异质的。第12页，共36页，星期日，2025年，2月5日二、杂交瘤技术的基本原理第13页，共36页，星期日，2025年，2月5日三、杂交瘤细胞的制备（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第14页，共36页，星期日，2025年，2月5日HAT培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）第15页，共36页，星期日，2025年，2月5日（二）免疫小鼠免疫程序是：取6~8周龄Balb／C雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，3~5天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为l00?g，第二次为50?g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1×l06一1×107。第16页，共36页，星期日，2025年，2月5日（三）脾细胞的制备(1)引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；(2)无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5mL无血清培养