重组子导入和筛选精美生物医学.pptVIP

酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。重组子的筛选和鉴定根据载体的性状变化进行筛选根据载体的抗药性标记进行筛选01载体上的抗药基因：02抗氨苄青霉素基因03抗四环素基因04抗卡那霉素基因等05凡是转入了载体的细胞都获得了这种06抗药性，可以在平板上生长菌落。当带有完整抗药性基因的载体转化无抗药性细胞后，凡转入载体的细胞都获得了抗药性，能在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落，而未被转化的宿主细胞不能生长。根据载体抗药性标志插入失活选择

含有两个以上的抗药基因的载体，外源DNA片段插入其中一个基因，并导致这个基因的失活，就可用两个含不同药物的平板，互相对照，筛选含重组DNA的菌落，这就是插入失活效应。外源基因抗Amp抗Tet抗Amp抗Amp抗Tet抗Tet重组DNA空载体不含有载体或重组DNA?-半乳糖苷酶系统β-半乳糖苷酶系统载体：pUC、pGEM系列载体等带有一个来自大肠杆菌DNA的短序列，其中含有编码β-半乳糖苷酶（β-galatosidase）基因（LacZ基因）的调控序列和N端146个氨基酸的编码序列，在编码序列中插入了一个多克隆位点，但不破坏阅读框架，不影响功能。**重组子导入、表达与筛选

找找看……重组DNA导入的目的是什么？请简单描述需要被纯化掉的对象01转化率是什么？该怎么计算表达？02影响转化率的因素是什么？0301020304什么是转化（transformation）？将重组DNA分子引入细菌（原核细胞），使其在细菌体内扩增及表达的过程。什么是转染（transfection）?将噬菌体、病毒或以它们为载体构建的DNA重组体导入真核细胞的过程。一、重组DNA分子导入宿主细胞转染噬菌体基因重组体外包装噬菌体体外包装重组缺陷型：避免重组整合转化亲和型：较高的可转化性感染缺陷型：防止感染遗传互补型：利于筛选限制缺陷型:避免修饰和降解1)受体细胞的选择1原核细胞的转化（细菌转化）宿主细胞原核细胞：大肠杆菌

真核细胞：哺乳类动物细胞、酵母和昆虫细胞重组体分子导入原核细胞感受态细菌：细菌表面正电荷增加，细胞壁和膜的通透性增加，利于DNA分子的吸附和吸收（1）CaCl2转化：细菌处于0度，二价阳离子存在的低渗溶液中，细菌膨胀成球形，处于感受态。010203此时加热在42度的热冲击下进入细胞，在培养基上生长数小时后球形细胞恢复原状并繁殖。转化效率为105~106/ug电击法（electroporation）：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA进入微孔后，脉冲结束，细胞恢复。实验简单，不需要制备感受态菌，转化效率高109~1010/ug[原理]利用高压脉冲，在细菌细胞表面形成暂时性的微孔，重组DNA从微孔中进入，脉冲过后，微孔复原，在丰富培养基中生长数小时后，细胞增殖，重组DNA得到大量复制。什么叫转化子？DNA分子转化宿主细胞获得转化子的效率什么叫重组子？导入的外源DNA为重组DNA的转化子转化率：导入外源DNA分子后能稳定存在的宿主细胞010203040506转化子数/用于转化的DNA分子总数转化子数/宿主细胞总数计算示例，见书132页表达方式：影响因素：重组DNA：分子量小，转化率高；亲和性强的质粒载体转化率高；ccc质粒DNA载体转化率高受体细胞转化方法：电击法转化率最高；氯化钙法次之01农杆菌转化法02基因枪法2、导入植物细胞基因枪介法优点：（1）无宿主限制。可以对任何基因型材料进行转化研究；(2)靶受体几乎包括所有具有潜在分化能力的组织或细胞。（3）易于操作。1缺点：如转化频率低、结果的重复性差，易导致基因沉默，实验成本较高等。2（二）基因枪法3、导入动物细胞显微注射技术含目的基因的表达载体动物受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性动物输卵管或子宫转基因动物显微注射分裂分化移植发育脂质体法重组体脂质体受体细胞含有目的基因的重组宿主细胞（如细菌）可以通过规模化的基因工程生产目的蛋白（如激素）找找看……01020304基因表达系统有哪些？基因表达系统应该具有什么条件？重组子筛选的意义是什么？有哪些方法可以用来筛选重组子？最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高;表达产物稳定;生物活性高;表达产物容易分离纯化。第一节基因的表达系统与表达