TCVMA 201-2024 猫衣原体实时荧光RAA检测方法.docx

ICS11.220

CCSB41

团 体 标 准

T/CVMA201—2024

猫衣原体实时荧光RAA检测方法

Real-timeRAAmethodfordetectionofChlamydiafelis

2024-12-4发布 2024-12-4实施

中国兽医协会 发布

T/CVMA201

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前 言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国兽医协会提出并归口。

本文件起草单位：上海市动物疫病预防控制中心、陕西科技大学、宁波市疾病预防控制中心、武汉科前生物股份有限公司、上海市浦东新区畜牧水产技术推广中心、上海市嘉定区农产品质量安全中心、上海市宝山区动物疫病预防控制中心。

本文件主要起草人：刘健、钱卫东、李永东、周登元、盛文伟、王建、赵洪进、冯桂丹、桂亚萍、夏琦琦、王晓旭、齐新永、沈海潇、向蒙、唐聪圣、徐平、葛杰、俞向前、白艺兰、范卫、陶军、马玉玲、陈备娟、李媛媛、代鹏。

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基团和淬灭基团分开并产生荧光信号，RAA产物与荧光信号的增长存在对应关系。

6 实验材料

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猫衣原体实时荧光RAA检测方法

范围

本文件描述了猫衣原体实时荧光RAA检测方法的原理、实验材料和实验步骤。本文件适用于猫衣原体核酸检测。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法

GB19489 实验室生物安全通用要求

GB/T27401 实验室质量控制规范动物检疫

NY/T541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

缩略语

下列缩略语适用于本文件。

C.felis：猫衣原体（Chlamydiafelis）

Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（Cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）

PBS：磷酸盐缓冲盐水（Phosphatebufferedsaline）

RAA：重组酶介导的核酸扩增（Recombinase-aidednucleicacidamplification）RNA：核糖核苷酸（Ribonucleicacid）

原理

RAA是一种核酸恒温扩增技术，在恒温下（一般为37℃~42℃），重组酶和寡核苷酸引物结合形成蛋白-DNA复合物，该复合物能够移动寻找模板DNA中的同源序列，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，在DNA聚合酶的作用下，形成新的双链，产物呈指数级扩增。在exo探针中包含一个四氢呋喃残基（THF），其两侧分别为dT-荧光基团（FAM）和dT-淬灭基团（BHQ-1）。探针3’端通过适当的修饰（C3Spacer）被封闭，以阻止聚合酶的进一步延伸。只有当探针和目的DNA结合后，核酸外切酶Ⅲ（ExonucleaseⅢ，ExoⅢ）能够识别并切除THF残基，并解除3’端阻断，荧光

试剂

除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合GB/T6682的要求。

PBS缓冲盐水（0.01mol/LPBS，pH7.4）：用800mL蒸馏水溶解8gNaCl，0.2gKCl，1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，用HCl调节溶液的pH值至7.4，加水定容至1L，121℃高压灭菌15min。

DNA提取试剂盒。

RAA预混液：聚乙二醇10%，二硫苏糖醇2mmol/L，磷酸肌酸100mmol/L，肌酸激酶200ng/μL，三磷酸腺苷6mmol/L，三（羟甲基）氨基甲烷（pH7.9）100mmol/L，乙酸钾200mmol/L，脱氧核苷三磷酸400mmol/L。

引物和探针，按照附录A配制。

RAA荧光基础反应单元：包含重组酶，单链结合蛋白和DNA聚合酶的冻干粉。

280mmol/L乙酸镁。

阳性对照，见附录B。

阴性对照：pMD18-T空载体质粒。

耗材

带滤芯无DNA酶和RNA酶