基于分子动力学模拟的蛋白酶PB92工程化二硫键突变体稳定性设计研究.pdf

摘要

蛋白酶PB92是一种重要的工业酶制剂，广泛用于化工、洗涤、生物制造等行

业。运用蛋白质工程手段改造和设计活性更强、稳定性更高的蛋白酶PB92对于进

一步拓展其工业应用具有重要意义。然而，通过传统实验方法对蛋白酶PB92进行

改造和设计存在随机性强、筛选周期长、实验环境与设备要求高和无法进行蛋白酶

结构的动态研究等缺点，极大地延长了改造周期，耗费大量的人力、物力以及财力。

针对以上问题，本文选用研究成本低、可操作性强和可获取原子级构象动态变化等

特点的分子动力学模拟研究方法对蛋白酶PB92进行理性设计，通过向蛋白酶PB92

中引入半胱氨酸对形成二硫键，探究了二硫键对其突变体结构稳定性的影响以及使

用分子对接模拟探究了对突变体底物结合能力的影响。具体内容如下：

1.以PDB数据库中蛋白酶PB92的晶体结构1AH2为基础，利用Disulfideby

Design在线服务器对其潜在二硫键进行预测，共找到195个潜在的二硫键位点。为

避免酶活性受到明显影响，我们根据PB92离子结合位点、底物结合区域相关残基

分布等对上述二硫键位点进一步筛选，得到95个潜在二硫键位点。然后，对95个

蛋白酶PB92二硫键突变体模型进行结构稳定性预测，进一步筛选出3个蛋白酶

PB92二硫键位点用于后续突变体构建及其稳定性和底物结合能力的研究。

2.将筛选出的三个二硫键位点分别引入PB92构成三个单二硫键突变体(116C-

145C、A71C-86C、249C-261C)，同时将3个二硫键两两组合引入PB92构建出三个

双二硫键突变体(116C-145C71C-86C、116C-145C249C-261C、71C-86C249C-

261C)，探究了单个二硫键以及多个二硫键对蛋白酶PB92稳定性的影响。通过分子

动力学模拟对这6个突变体结构稳定性、致密性和二级结构进行分析，得出引入二

硫键能够提高蛋白酶PB92的稳定性，其中含二硫键A71C-A86C和T249C-L261C

的双二硫键突变体的稳定性最佳。

3.进一步研究了6个突变体的热稳定性，并利用分子对接分析了突变体与底物

之间的相互作用，对6个突变体的底物结合能力进行了评估，得出引入二硫键后对

蛋白酶PB92的热稳定性和底物结合能力有不同程度的影响，其中，含二硫键

A71C-A86C和T249C-L261C的双二硫键突变体的热稳定性提高而底物结合能力不

受影响。

综上结果表明，含二硫键71C-86C和249C-261C的双二硫键突变体比野生型和

I

其他突变体热稳定性更高且不影响其底物结合性能。这些研究结果为基于分子动力

学模拟的蛋白酶PB92工程化二硫键突变体稳定性设计提供了一定的理论基础，也

为构建高稳定性蛋白酶PB92提供了方案。

关键词：蛋白酶PB92；分子动力学模拟；二硫键；稳定性

II

ABSTRACT

ProteinasePB92isanimportantindustrialenzymepreparationwidelyusedin

industriessuchaschemicalengineering,detergentmanufacturing,andbioprocessing.The

rationalredesignandengineeringofPB92toenhanceitsactivityandstabilityarecrucial

forfurtherexpandingitsindustrialapplications.However,conventionalexperimental

methodsforthemodificationanddesignofPB92sufferfromdrawbackssuchas