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核酸扩增杂交基础及测序核酸扩增、杂交变性，复性——PCR的依据解链温度杂交——southern，northern，而westernblot虽与上述杂交相似，但所依据原理不同C0t1/2是指什么?具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。探针带有供反应后检测的合适标记物，并仅与特异靶分子反应。杂交有固液相杂交和液相杂交。核酸分子杂交的基本原理变性复性DNA-DNA杂交双链分子DNA变性与复性DNA变性定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。（2）变性的方法：(3)变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加(4)DNA变性曲线AT区先解链GC区后解链阶梯式曲线01GC含量与Tm值之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.4402Tm=(G+C)%×0.41+69.3定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。01具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：02DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。032、复性单链分子间碰撞形成局部双链01局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离02局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列03形成完整的双链分子04（2）复性过程核酸变性后的复性速度取决于核酸分子的复杂性：核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度Cot?与反应体系中核酸复杂性成正比两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性Southern印迹杂交待测核酸样品的制备裂解或破碎细胞抽取纯化基因组DNA限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段杂交举例2、待测DNA样品的电泳分离琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶分离小片段用高浓度胶凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小相同的分子处于同一条带分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂交所用分子量标准可用核素标记凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的01单链DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液023、凝胶中核酸的变性（碱变性）Southern印迹根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA印迹杂交技术。由于它是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫SouthernDNA印迹转移技术。（a）（b）（c）（d）（e）基因组DNADNA限制片段硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段X光底片预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点预杂交液为不含DNA探针的杂交液杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA5、Southern杂交放射自显影：适用于放射性核素标记的探针比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针01026、杂交结果检测SouthernDNA印迹杂交之X光显像图片水稻（OryzasativaL.)的叶绿体DNA分别用核酸内切限制酶BglⅡ(A-C)、BamHⅠ（D-F）、EcoRⅠ（G-I）、和HindⅢ（J-L）消化，加样在含有EtBr染料的1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32P标记的玉米psbA探针作Southern杂交。X光底片中显现的阳性条带，表明含有水稻的psbA基因序列。Southern杂交分析示例A.DNA体外重组实验B.抗生素筛选转化子细胞C.培养突变株细胞D.Southern杂交实验结果显示，外源目的基因已经转入突变株细胞中1973年，由美国斯坦福大学教授Cohn和美国加州大学教授Boyer带领各自的研究组几乎同时分别完成了DNA体外重组，一举打开了基因工程学大门。Northern印迹杂交1979年，J.C.Alwine等人发展而来，与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺