蛋白质的Wesrern印迹分析.pptVIP

刘二战一、原理一个基因表达的最终产物是产生相应的蛋白，因此检测蛋白是测定基因表达的主要标志。原理：WesternBlotting是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离；并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜进行杂交，使其与膜上的靶蛋白特异性结合；再与经辣根过氧化物酶标记的二抗结合，最后用ECL试剂反应，经X线片曝光、显影等一系列反应，检测蛋白质等生物大分子。二、方法添加标题样品蛋白的制备添加标题SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳添加标题转膜添加标题检测三、样品蛋白的制备原理：蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理只有两个方面：一是用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使备组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳、超速离心、超滤等。三、样品蛋白的制备2、蛋白质制备的步骤选择材料和预处理细胞的破碎及细胞的分离提取和纯化浓缩、干燥和保存三、样品蛋白的制备3、培养细胞中蛋白质样品的提取提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的原理，在提取蛋白质的实验中要考虑到细胞裂解液的pH、去污剂的类型和浓度，以及二价阳离子、辅助因子等因素，同时为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解，需在裂解液中加入蛋白酶抑制剂。三、样品蛋白的制备3.1实验材料（1）器材：冷冻离心机，细胞刮，Tip头、1.5ml、0.5ml灭菌Ep管，碎冰。（2）试剂：①细胞总蛋白裂解液（100ml）:1×PBS80ml，Triton-1001ml,去氧胆酸钠0.5g,SDS0.1g,补1×PBS缓冲液至100ml。②PMSF贮存液（PMSF17.4mg/异丙醇）：PMSF（苯甲基磺酰氟）在水溶液中不稳定，应在临用前向不含PMSF的裂解缓冲液中加入PMSF贮存液100ul,使其终浓度为0.174mg/ml。（3）Hela细胞三、样品蛋白的制备洗涤细胞：选取细胞培养皿中培养的Hela细胞，由37℃取出后放入冰盘中，预冷。吸弃原培养液，用4℃预冷的1×PBS洗细胞表面3～4次，除净培养基中的血清，并尽量吸弃细胞培养皿中残余的PBS。向培养皿中加入蛋白裂解液(100ul/60mm)，轻轻晃动，使裂解液均匀铺于细胞表面。冰浴30～60min，期间晃动3～4次。用细胞刮子集中裂解液，收集入冰上预冷的1.5mlEp管中，4℃离心，12000g20min.小心吸取上清液入新的预冷管中（为避免反复冻融导致蛋白降解，可按需要将其分装使用），-80℃保有存备用（可保存1年）123453.2实验方法三、样品蛋白的制备所用离心机需要提前预冷。注意个人防护：PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收有致命危险。一旦眼晴或皮肤接触了PMSF，立即用大量清水冲洗。为防止蛋白降解，上述操作全部应在冰上完成。设立必要实验对照。吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。可于显微镜下观察细胸裂解的程度。3.3注意事项蛋白质的浓度测定——考马斯亮蓝蛋白定量法考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。4.1原理考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。三、样品蛋白的制备三、样品蛋白的制备4.2实验材料（1）器材：分光光度计及玻璃比色皿（2）试剂：①0.5%mg/mlBSA标准蛋白液：生理盐水配制，分装小管，4℃保存。②考马斯亮蓝G-250母液：称取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml浓磷酸(W/V)。过滤，4℃保存6个月。③考马斯亮蓝G-250使用液（0.01%考马斯亮蓝G-250）：取考马斯亮蓝G-250母液15ml，加蒸馏水稀释至85ml，临用前稀释。三、样品蛋白的制备稀释BSA标准品及制作标准曲线：用生理盐水将0.5mg/ml牛血清白蛋白（BSA）标准蛋白液稀释成0,1,2,4,8,