工具酶的概念代谢物测定中常用的指示反应BASICCLINI.pptx

工具酶的概念、代谢物测定中常用的指示反应BASICCLINICALLABORATORYMEDICINE1

一、工具酶概念：通常把酶学分析技术中作为试剂用于测定代谢物浓度或酶活性的酶称为工具酶（toolenzyme）。常用的工具酶多为氧化还原酶类，这是因为氧化还原酶的产物最容易被直接监测。

表5-3常用工具酶的名称及其缩写符号名称缩写辅酶名称缩写符号乳酸脱氢酶LDHNAD＋己糖激酶HK苹果酸脱氢酶MDHNAD＋肌酸激酶CK6-磷酸葡萄糖脱氢酶G6PDNADP＋丙酮酸激酶PK谷氨酸脱氢酶GLDH甘油激酶GK葡萄糖氧化酶GOD脂蛋白脂肪酶LPL胆固醇氧化酶COD胆固醇酯酶CE磷酸甘油氧化酶GPD脲酶Ure过氧化物酶POD肌酐酶Cr

例如葡萄糖的测定中，在己糖激酶（HK）催化下，葡萄糖和ATP发生磷酸化反应，生成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)与ADP。前者在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)催化下脱氢，生成6-磷酸葡萄糖酸内酯，同时使NADP还原成NADPH，然后检测340nm吸光度的改变，间接测得葡萄糖浓度。在这里，血清葡萄糖为待测物，HK、G-6-PD为工具酶，其作用相当于试剂。检测其340nm吸光度的改变，即可间接测得葡萄糖浓度GG-6-P6-磷酸葡萄糖酸内脂HKG-6-PDATPADPNADPNADPH+H+NADPH+H+待测物工具酶

二、酶偶联法酶偶联反应最简单的模式为：Ex为待测酶，A为底物，B为中间产物。A、B二物质的变化无法直接监测，此时可外加第二个酶Ei(为指示酶)，其底物为B，反应产物为P可直接测定。

辅助反应如果一些酶促反应找不到合适的指示酶与其直接偶联，此时还可在始发反应和指示反应之间加入另一种酶，将二者连在一起，此反应称为辅助反应。模式为：其中B、C均为中间产物，Ea、Ei都为工具酶。最后一个酶称指示酶Ei，其他外加的酶都为辅助酶（Ea）。

酶偶联反应原理:预孵育期延滞期线性反应期非恒态期先将Ei加入样本中保温，使内源性A和B消耗殆尽。然后加入底物启动反应，开始反应速度较慢。随着反应的进行B的生成速度等于转化为P的速度，反应达到动态平衡。反应后期，底物已经大部分消耗，反应速度减慢。

酶偶联法测定ALT的吸光度变化图在应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，因为只有恒态期才能代表酶活性。如酶促反应底物动力学所述，恒态期可以通过测定指示酶的Km和Vmax等动力学因数加以计算确定。

三、常用指示酶及其指示反应1．脱氢酶用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱氢酶，例如LDH、MDH、G-6-PD、GLDH等，它们催化下列反应：P+NAD(P)H+H+?PH2+NAD(P)+可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定应用：ALT、AST、CK等酶活性测定。

优点:应用广泛缺点：①要用紫外分光光度计，因为要监测340nm吸光度变化，这限制了它的应用；②要求使用高纯度的酶和辅酶，增加费用；③灵敏度低。这是因为NAD(P)H的摩尔消光系数只有6.22×103。

2．过氧化物酶（POD）POD可催化过氧化氢与某些色原反应，例如与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：Trinder反应：POD2H2O2+4-AAP+酚醌亚胺（红色）+4H2O色原物质应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通过Trinder反应加以测定。

优点：①在可见光范围测定，便于推广应用；②对酶的纯度要求不高，故生产方便，价格低廉；③灵敏度高于脱氢酶系统。缺点：容易受维生素C、尿酸、胆红素和谷胱甘肽等还原性物质的干扰，严重时测定结果会出现假性负值。目前一般采用双试剂剂型，在试剂1中加入抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾等来消除维生素C、胆红素等的干扰。

呈色系统酶底物显色剂呈色氧化酶oxidase过氧化物酶（POD）供氧体（oxygendonor）邻联甲苯胺(OT)四甲基联苯胺（TMB）四甲基联苯胺加硫酸邻联茴香胺(ODA)邻联茴香胺加硫酸4-氨基安替比林(4-AAP)3-甲基-2-苯并噻唑酮腙（MBTH）蓝色蓝色黄色黄色红色红色深红色脱