重组DNA的构建、筛选及鉴定分析.pptVIP

01020304转化是感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达DNA分子的基因转化方法显微注射技术是一种利用显微注射仪，通过机械方法把外源DNA直接注人细胞质或细胞核的基因转化方法转导是指通过噬菌体将一个宿主的DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象电转化法也称为电穿孔法在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，结果在质膜上形成纳米大小的微孔，DNA能直接通过这些微孔，或者在膜孔自行修复闭合时伴随膜组分的重新分布而进人细胞质中三重组DNA分子导入受体菌基因枪法，又称微弹轰击法是利用高速运行的金属颗粒轰击细胞时能进人细胞内的现象，将包裹在金属颗粒表面的外源DNA分子随之带人细胞进行表达的基因转化方法。01原核生物细胞大肠杆菌枯草杆菌02真菌细胞酵母菌细胞03植物细胞04动物细胞宿主细胞一是大量产生重组DNA在完成连接反应后，重组DNA往往只有纳克级的量，不易操作和进一步分析二是对重组DNA进行纯化。在构建重组DNA过程中很难保证体系中不污染其他的DNA分子转化的目的第二节重组子的筛选利用抗药性基因的筛选方法b一半乳糖昔酶显色互补筛一、遗传表型筛选法遗传表型筛选法01抗性标记直接筛选法载体DNA上携带有宿主细胞敏感的抗生素的抗性基因，pBR322质粒载体，它上面含有的氨卞青霉素抗性基因和四环素抗性基因02利用抗药性基因的筛选方法抗性基因插入失活筛选法当用某种限制性核酸内切酶消化并在此位点插入外源目的DNA时，抗药性基因不再被表达，称为基因插入失活。因此，当此插人外源DNA的重组质粒载体转化宿主菌并在药物选择平板上培养时，根据对该药物由抗性转变为敏感这一特征，观察菌落生长状况便可筛选出阳性重组子质粒载体抗性标记筛选ABb一半乳糖苷酶显色互补筛选利用抗药性基因的筛选方法β-半乳糖苷酶可被安慰诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）诱导的启动子调控之下β-半乳糖苷酶能把培养基中无色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝蓝-白筛选营养缺陷型是指某菌株经突变后，丧失了合成某营养素(氨基酸，维生素，核酸等)的功能，若在培养基上培养必须添加相应的营养素才能生长如果外源基因能够实现其功能的表达,重组DNA转化到大肠杆菌宿主细胞之后，则它所表现出来的表型性状即可作为重组子筛选的标记营养缺陷互补当外源目的基因为合成亮氨酸的基因时，将该基因重组后转人缺少亮氨酸合成酶基因的菌株中，在仅仅缺少亮氨酸的基本培养基上筛选，只有能利用表达产物亮氨酸的细菌才能生长，因此，获得的转化子都是重组子二、快速裂解菌落鉴定重组DNA分子DNA分子由于外源目的基因片段插人到质粒载体上，所以重组质粒的相对分子量一定比非重组质粒要大核酸分子杂交检测法其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链，在一定的复性条件下，可按碱基互补原则退火形成双链分子杂交方法可分为固相液相杂交、液相分子杂交和原位杂交固相液相杂交，亦称膜上印迹杂交提取重物重组质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分离碱变性液浸饱中和液漂洗进行DNA印迹转移℃下烘烤1h或短波紫外线交联法固定DNA与放射性同位素标记探针杂交放射自显影后～确定阳性重组子southern印迹杂交一是防止单链RNA形成高级结构，故必须采用变性凝胶电泳；二是电泳过程中始终要有效抑制RNase的作用该法主要针对RNA分子的检测Northern印迹杂交由于RNA分子与硝酸纤维素膜结合能力相对较差直接把菌落或噬菌斑印迹转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，不必进行核酸分离纯化、限制性核酸内切酶酶切及凝胶电泳分离等操作，而是经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再与特异性DNA或RNA探针杂交，筛选出阳性菌落或噬菌斑，即含有目的基因的重组子01菌落（或噬菌斑）原位杂交菌落原位杂交技术02DNA探针就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是基因的一部分检测灵敏度高；标记方法简单；相对稳定，保存时间长；特异的理化性质如光*第十章重组DNA的构建、筛选及鉴定分析1.重组DNA导入宿主细胞2.重组子的筛选3.阳性重组子的验证与分析一目的基因的获取5’M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n