DB36T 1036-2018 芝麻细菌性青枯病诊断及检测技术规程　.docxVIP

ICS65.020.20B15

DB36

江西省地方标准

DB36/T1036-2018

芝麻细菌性青枯病诊断及检测技术规程

TechniquelyRulesforDiagnosisandDetectionofSesameBacterialWilt[RalstoniasolanacearumSmith]

2018-07-03发布2019-01-04实施

江西省质量技术监督局发布

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I

目次

前言 II

1范围 1

2术语和定义 1

3症状诊断 1

4病原菌形态学鉴定与致病性测定 1

5病原菌PCR检测 2

附录A（资料性附录）培养基配制方法 3

附录B（资料性附录）PCR检测引物、反应体系条件 4

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II

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。

本标准由江西省农业厅提出并归口。

本标准起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所、江西生物科技职业学院。

本标准主要起草人：华菊玲、李信申、黄小梅、刘清兰、熊艳、黄瑞荣、王希、史建苗、盛琦、饶喜。

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1

芝麻细菌性青枯病诊断及检测技术规程

1范围

本标准规定了芝麻细菌性青枯病（Sesamebacterialwilt）诊断及检测技术的术语和定义、症状诊断、病原菌形态学鉴定与致病性测定和病原菌PCR检测。

本标准适用于芝麻细菌性青枯病症状诊断、病原菌形态学鉴定及PCR检测。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。2.1

16srRNA序列

细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。具有高度的保守性和特异性。16srRNA基因检测技术已成为病原细菌检测和鉴定的重要方法。

2.2

ITS序列

16S～23SrRNA基因区间的一段高度可变序列，该区域种间多态性丰富，而种内却非常保守，这些特点使得它在细菌分类鉴定研究上具有独特的优势。

3症状诊断

初期在茎杆上出现暗绿色水浸状斑块，继而呈黑褐色条斑向上下扩展，顶梢常有2个～3个梭形溃疡状裂缝，部分病茎溃疡状裂缝可延伸至茎杆中下部，溃疡状裂缝出现早而多的病株常呈畸形。病株顶端先出现萎蔫，继而整株呈失水状，早期夜间可恢复正常，后期则呈黑褐色枯死。病株茎部维管束变褐色，髓部空洞。折断茎杆常可见菌脓形成的透明细丝。茎杆表皮下常可见泡状隆起，刺破后有乳白色菌脓溢出，渐成为漆黑色晶亮的颗粒。

4病原菌形态学鉴定与致病性测定

4.1菌株分离与形态学鉴定

4.1.1菌株分离

采集典型的芝麻细菌性青枯病标本，剪取病健交界处病茎3cm～4cm，经75%酒精消毒、灭菌水冲洗后，剪去两头取中间段置于装有5ml～10ml无菌水的试管中静置5min左右至悬浮液变混浊，用接种环蘸

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2

取少量粗悬液分别在NA平板和TZC平板上划线或涂布。28℃培养72h后观察菌落形态。挑取典型菌落，进行光学显微镜下菌体的革兰氏染色、鞭毛染色和形态观察。

4.1.2形态学鉴定

根据以下形态学特征作为鉴定依据。青枯菌革兰氏染色反应为阴性，菌体杆状，具1根～4根极鞭，无荚膜。在NA培养基平板上于28℃培养72h，见附录A，菌落呈污白色，平滑有光泽，呈粘液状，直径2mm~3mm。在2,3,5-氯化三苯基四氮唑（简称TZC，下同）选择性培养基上，28℃培养72h，产生的菌落呈不规则圆形，具流动性，中心呈红色至桔红色，边缘为白色，菌落直径2mm～5mm。

4.2菌株致病性测定

4.2.1接种体制备

将形态学鉴定为青枯菌(R.solanacerum)的菌株于NA平板上培养活化48h后，配成1×108CFU/ml菌悬液供接种备用。

4.2.2接种期

芝麻初花期进行接种。用制备的菌悬液，回接芝麻健株，并以无菌水作为对照。

4.2.3接种方法

在26℃~30℃温室保湿条件下，采用以下3种方法接种：

——剪叶接种：选择完全展开的叶片，用灭菌剪刀蘸取菌液剪叶；

——针刺接种：用灭菌的小号注射器抽取菌液，在茎杆中部叶腋处针刺注射菌液，每株注射菌液0.1ml；

——伤根灌菌液接种:用小铁铲从距茎基2cm～3cm处斜插入土，随后每株灌入菌液30ml。

4.2.4结果调查

接种10d～14d后，观察接种植株是否产生典型症状。选取典型症状