聚合酶链反应及基因突变检测方法.ppt

1、温度变性温度：94~97℃退火温度：低于引物Tm5℃左右温度过高：降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶促活性第23页，共75页，星期日，2025年，2月5日2、时间第一次变性应给予足够时间（5~7分钟）每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒~1分钟，时间过长易导致非特异性扩增第24页，共75页，星期日，2025年，2月5日3、循环次数重复次数一般设为25～35个循环扩增反应的平台效应：理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长第25页，共75页，星期日，2025年，2月5日指数增长期线形增长期平台期循环数#理论值实际值Log产物DNAPCR过程的实时监测第26页，共75页，星期日，2025年，2月5日平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。平台效应产生的因素：引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等第27页，共75页，星期日，2025年，2月5日三、PCR技术的质量控制（一）实验室的规范化设置实验室的规范化设置：试剂贮存和准备区标本制备区扩增反应区产物分析区PCR技术的质量保证：基因扩增检验的全过程的质量保证室内质量控制和室间质量评价PCR实验系统中的污染源及防污染措施第28页，共75页，星期日，2025年，2月5日防污染体系：正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施、反应体系中以dUTP取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可破坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质量第29页，共75页，星期日，2025年，2月5日（二）PCR技术的质量保证分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理、贮存分析中因素：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等）分析后因素：报告形式、反馈的信息等第30页，共75页，星期日，2025年，2月5日第二节以PCR为基础的相关技术第31页，共75页，星期日，2025年，2月5日以PCR为基础的相关技术逆转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)定量PCR(quantitativePCR)多重PCR(multiplexPCR)免疫PCR差异显示PCR(differentialdisplayPCR,DD-PCR)PCR诱导定点突变原位PCR(insituPCR)第32页，共75页，星期日，2025年，2月5日一、逆转录PCR（RT-PCR）以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。主要用于克隆cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等第33页，共75页，星期日，2025年，2月5日逆转录生成cDNA方式：以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物，mRNA3`末端polyA尾与之互补以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增第34页，共75页，星期日，2025年，2月5日第35页，共75页，星期日，2025年，2月5日二、定量PCR对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析。主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等在定量PCR反应体系中，除了常规PCR反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是?-肌球蛋白基因第36页，共75页，星期日，2025年，2月5日绝对定量PCR外参照系统的设置内参照系统的设置实时定量PCR对核酸扩增反应进行直接和动态的监测，实现对靶基因的实时定量分析第37页，共75页，星期日，2025年，2月5日荧光定量PCR（fluorescencequantitativePCR,FQ-PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测PCR的方法FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监测，精确计算出PCR的初始模板量第38页，共75页，星期日，2025年，2月5日荧光信号的检