重组门冬酰胺酶制备表达纯化.pptVIP

酶类药物

--重组门冬酰胺酶Ⅱ表达和制备酶的分类门冬酰胺酶ⅡL?-天门冬酰胺酶AnsB?能催化天门冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。淋巴瘤和白血病细胞通常不能合成天门冬酸胺，L?-天门冬酸胺酶将阻止癌细胞蛋白质合成而导致癌细胞死亡。在临床上，L?-天门冬酰胺酶已广泛用于治疗白血病和淋巴瘤。但目前国内尚不能生产，国外也仅有低产酶能力的大肠杆菌野生株产品，生产成本高，药价昂贵。基因工程菌产品既能填补国内空白，又能大幅度降低生产成本。参

考

文

献1---重组与表达刘景晶，李晶，吴梧桐，胡梅清.《大肠杆菌L-天门冬酰胺酶Ⅱ基因的高效表达》中国药科大学生物化学教研室,南京210009南京铁道医学院生物化学教研室,南京2100092---提取与纯化刘景晶,金健勤,戴海滨,吴梧桐.《大肠杆菌L门冬酸胺酶的提取和纯化》中国药科大学生化教研室,南京210009材料限制酶Ncol?、Hind?III及T4DNA?连接酶，购自Promega?公司；Taq?酶、dNTP?、IPTG?购自华美公司；丙烯酰胺、N,N’?-甲叉双丙烯酰胺、SDS购自sigma?公司。pKK233?-2?购自clonetech?公司；pKK233?-ansB?是将代PCR?扩增得到的AnsB?基因DNA?用Ncol?和Hind?III消化后，定向插入pKK233?-2?的多克隆位点而得到的重组质粒。重组与表达01实02验03方04法05PCR扩增AnsB基因06重组质粒PKK233-ansB的构建07阳性转化子的筛选PCR扩增AnsB基因模板的制备：用接种环挑取CPU210009菌体少许，在裂解液(1﹪TritonX-100,2mmol/LTris-HClpH8.5,2mmol/LEDTA)1ml中振散，95C加热处理液10min,吸取处理液5ul用于PCR。引物：E1:5‘-GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCACITGC?一3′E2:5′-GGAAGCTTGAGAATGCCGTGATAC?一3′? 11：5′-GGCCATGGAGT111TCAAAAAGACGCACTTGC一3′12:5′-GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG?一3′扩增条件：84C变性1min;60C复性2min;72C延伸1min?；循环28次。重组质粒PKK233-ansB的构建PcR?扩增后的DNA片段及质粒pKK233?-2?同时分别用限制酶Ncol?和Hindl?消化并用琼脂搪凝胶电泳分离和回收质粒大片段；将消化后的DNA?片段和电泳回收的质粒大片段用T4.DNA?连接酶连接，连接产物经琼脂糖凝胶电泳回收后转化HB101?、71/15?、ATCc9637?、JM107?、cPU210009?，筛选获得相应的阳性转化子。阳性转化子的筛选将涂布在含氨节青霉素的LB?平板上生长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜LB?平板上，为每个克隆编号。平板置37C?温箱中过夜，待菌落形成后，用灭菌牙签逐个挑取少量菌体，移入预先加有0.1mol/L?硼酸缓冲液（pH8.4)50ul的酶标板反应孔内，待菌体分散后，每孔各加入0.04mol/L?天门冬酞胺底物溶液50?ul,37C?保温15min?，加奈氏试剂50?ul，呈深棕红色孔内对应的单菌落即为阳性转化子。酶的纯度01酶的浓度02金属离子03pH04温度、时间05晶种06条件选择2020防止酶蛋白变性012021防止复因子丢失022022防止酶被蛋白水解酶降解03酶的分离纯化工作中的注意事项

提

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化蔗糖溶液提取法L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）酶活力的测定酶分子量测定

提取

纯化