细胞破碎、蛋白质复性、固液分离.pptVIP

生物别离过程的一般流程;细胞破碎、蛋白质复性

和固液别离;本章介绍的细胞破碎和固液别离操作属于初级别离阶段。它们主要影响产物的收率，但在某种意义上也影响产物的纯度，因为如果能在初级别离中除掉大局部杂质，特别是一些对后续精制阶段有干扰的杂质，那么产物精制也会变得较容易，纯度也容易得到保证。;第一节、细胞破碎;有的基因工程产物是胞内物质，别离提取这类产物时，必须破坏细胞膜，使产物得以释放，才能进一步提取。由于常用的手段通常是将整个细胞破碎，因此习惯上将该操作称为细胞破碎。细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤，它直接影响产物的活性、收率和本钱。;一、细胞壁的组成与结构

细胞破碎的目的是破坏细胞外围使胞内物质释放出来。微生物细胞的外围通常包括细胞壁和细胞膜，它们起着支撑细胞的作用。其中细胞壁为外壁，具有固定细胞外形和保护细胞免受机械损伤或渗透压破坏的功能。细胞膜为内壁，是一层具有高度选择性的半透膜，控制细胞内外一些物质的交换渗透作用。;细胞膜的结构;细胞膜较薄，厚度为7~10nm，主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差，易受渗透压冲击而破碎。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物其细胞壁的结构特性是不同的，取决于遗传和环境因素。为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解它们的组成和结构。;肽聚糖是细菌细胞壁的主要化学成分，它是一个大分子复合体，有多糖链借短肽交联而成。这些短肽连接在N-乙酰胞壁酸的残基上，相邻的短肽又交叉相连，形成了机械性强度很大的网状结构。

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细胞破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，其网状结构的致密程度和强度取决于多糖链上所存在的肽键数量和其交联的程度。交联程度越大，网状结构就越致密，破碎的难度也就越大。

革兰氏阳性细菌的细胞壁与革兰氏阴性细菌有很大不同。;革兰氏阳性细菌的细胞壁结构;革兰氏阳性细菌的细胞壁较厚，主要由肽聚糖组成〔占40%~90%〕，其余是多糖和胞壁酸。其肽聚糖结构为多层网状结构，其中75%的肽聚糖亚单位相互交联，网格致密稳固。;革兰氏阴性细菌的细胞壁;革兰氏阴性细菌的细胞壁包括内壁层和外壁层，内壁层较薄〔2~3nm〕，由肽聚糖组成；外壁层较厚〔8~10nm〕，主要由脂蛋白和脂多糖组成。革兰氏阴性菌细胞壁的肽聚糖为单层网状结构，它们只有30%的肽聚糖亚单位彼此交联，故其网状结构不及革兰氏阳性细菌的稳固，显得比较疏松。;2、酵母菌细胞壁

酵母菌细胞壁比革兰氏阳性细菌要厚，大多为100~300nm，但不及革兰氏阳性细菌细胞壁坚韧。幼细胞的细胞壁胶薄，有弹性，以后逐渐变厚、变硬。研究说明，有可能仅有一局部厚度对细胞壁的刚性和强度起重要作用。;酵母细胞壁有特殊的酵母纤维素构成，其主要成分是葡聚糖〔30%~34%〕、甘露聚糖〔30%〕、蛋白质〔6%~8%〕和脂类，不含一般真菌所具有的几丁质或纤维素。细胞壁的结构可分为三层。最里层为葡聚糖层，它构成了细胞壁的刚性骨架，使细胞具有一定的形状。外层是甘露聚糖层，也是一种分支聚合物。葡聚糖层与甘露聚糖层之间靠处于中间的蛋白质交联起来，形成网状机构。近10%的甘露聚糖的侧链通过磷酸二酯键与磷酸连接。

同细菌细胞壁一样，酵母细胞壁破碎的阻力主要决定于细胞壁结构交联的紧密程度和它的厚度。;3、霉菌细胞壁

由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。;霉菌细胞壁厚度100~250nm，主要由多糖组成〔80%~90%〕，其次含有较少的蛋白质和脂类。不同的霉菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成的。;红面包霉菌细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三种聚合物

最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混合物，

第2层(b)是糖蛋白的网状结构

第3层(c)主要是蛋白质，

最内层(d)主要是几丁质。;植物细胞壁的结构;植物细胞初生壁的化学组成;某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上)，常有三层组成。

在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规那么，而且存在木质素的沉积。

因此次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。;4、细胞壁结构与细胞破碎

微生物细胞壁的形状和强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互关联的程度。为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。各种微生物细胞壁的组成和结构差异很大，取决于遗传信息、培养生长环境和菌龄。此外，霉菌的细胞壁结构还随培养过程中机械搅拌作用的强弱而变化。

;在机械破碎中，细胞的大小和形状以及细胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎难易程度的重要因素。显然，细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。虽然通过改变遗传密码或培养的环境因