细胞信号转导研究方法.ppt

钙调素的定量测定酶法：根据CaM依赖的酶（PDE、NAD激酶、Ca-ATP酶等）激活的程度，使用广泛免疫学法：RIA和ELISA（抗体，特异性强、测定CaM的总量，非活性）第30页，共71页，星期日，2025年，2月5日磷酸化的信号转导分子酪氨酸磷酸化、苏氨酸残基磷酸化及丝氨酸残基磷酸化蛋白鉴定通常是首先分离粗提蛋白，采用针对含这些氨基酸残基磷酸化蛋白的单克隆抗体进行免疫沉淀,SDS电泳，然而采用Westernblotting鉴定其分子量，进一步利用分子生物学技术克隆信号蛋白，搞清其基因结构和氨基酸序列。第31页，共71页，星期日，2025年，2月5日免疫学法蛋白质印迹：抗体（如抗p-Thr）、样品匀浆液加入蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂或蛋白激酶抑制剂；目标蛋白印迹发生移位免疫组织化学：磷酸化蛋白在亚细胞定位和动态变化流式细胞术：荧光抗体第32页，共71页，星期日，2025年，2月5日磷酸化蛋白组学高分辨率质谱磷酸酶抑制剂使用：钒酸钠（酪氨酸磷酸酶）、冈田酸（丝/苏氨酸磷酸酶）、氟化钠、焦磷酸钠、甘油磷酸钠（广谱、非特异磷酸酶）第33页，共71页，星期日，2025年，2月5日激酶活性的测定常见激酶活性的测定有PTK、PKC及PI-3K等。均有商品化的试剂盒。检测原理：根据激酶可以催化特定底物发生磷酸化，外源加入32γ-ATP，通过分离反应产物后测定放射活性，从标准曲线推算出样品酶的活性。PKC从胞质向胞膜的转位是PKC活化的一个重要指标，因而分离胞质和胞膜中的PKC并分别测定其活性，计算胞膜上PKC活性占总PKC活性的比例，从而判定PKC的活化程度。第34页，共71页，星期日，2025年，2月5日蛋白质表达水平和细胞内定位研究信号蛋白分子表达水平及分子量检测westernblotanalysis信号蛋白分子在细胞内定位研究immunohistochemistry/immunnocytochemistryImmunofluorescence（IF）Greenfluorescentprotein（GFP，livecells）第35页，共71页，星期日，2025年，2月5日westernblotSDS→转膜（PVDForNC）→封闭→一抗→洗涤→标记二抗→洗涤→显色或化学发光显影第36页，共71页，星期日，2025年，2月5日SDS作用：确定蛋白质纯度、确定蛋白质亚单位的分子量考染：检测含0.1ug蛋白质条带银染：灵敏度高100倍第37页，共71页，星期日，2025年，2月5日印迹膜上蛋白质染色：聚偏氟乙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜氨基黑染色：蛋白质测序和蛋白质原位切割，首选染料（检测最小量：50ng）考染：除NC膜外（50ng）丽春红S：适用印迹膜用于二次检测（westernblot）（200ng），条件摸索成熟后，不建议染色胶体金、胶体银、印度墨汁、荧光胺标记第38页，共71页，星期日，2025年，2月5日检测目标蛋白：结合PAGE的高分辨率和固相免疫反应的高特异性，可检测1-5ng、中等分子量的靶蛋白上样量：目标蛋白量不应太低膜的选择：蛋白质的分子量（孔径）封闭液：20%BSA→10%脱脂奶粉→10%马血清抗体：内参检测系统：辣根过氧化物酶-ECL结果分析：背景过高：洗膜不充分、抗体浓度过高、封闭不充分；条带过浅：抗体浓度不够、效价降低、曝光过短、蛋白含量低Strippingbuffer漂洗，去除一结合的一抗和二抗，多次使用第39页，共71页，星期日，2025年，2月5日免疫荧光技术

Immunofluorescence（IF）利用某些荧光素如FITC等通过化学反应与抗体或其他蛋白结合制备成荧光探针，然后与待测抗原或配体发生特异性结合，形成的复合物在一定的波长光的激发下，可产生荧光，利用荧光显微镜对抗原进行定性或定位的检测。采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群的蛋白质分子，用两种荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内检测两种不同的分子（DoubleIF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子检测。第40页，共71页，星期日，2025年，2月5日蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术Co-IP（免疫共沉淀)GSTpulldownassayYeastormammaliantwohybridassayFRET（fluorescenceresonanceenergytransferassay)第41