重组体的筛选.ppt

Southern杂交定位kan抗性基因添加标题直接凝胶电泳检测法添加标题利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。添加标题从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。添加标题分子量Marker添加标题载体添加标题重组克隆实验步骤bp—1534—994—695—515—377—237ABCM单击此处添加小标题酶切电泳筛选法单击此处添加小标题原理单击此处添加小标题根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）单击此处添加小标题用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果。ABA或B不同克隆的酶切结果筛选过程第二节免疫化学与核酸分析法0102一、放射性抗体检测法利用抗体作为“探针”来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交”1.抗体与产物的结合方式根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗125I标记的二抗固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗固相支持滤膜固相支持滤膜待测基因产物蛋白一抗二抗125I标记的二抗结合蛋白125I标记的二抗第八章重组体的筛选检测将目的DNA片段与载体连接形成重组子，然后通过各种方法将重组子导入宿主细胞，得到所需要的带有重组DNA的转化子，这是基因工程的目的所在。PARTONE转化子：导入外源DNA后获得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。01重组子的鉴定可以从直接和间接两个方面分析，可以从DNA、RNA和蛋白质三个不同水平进行鉴定。02重组子的筛选直接筛选间接筛选DNA鉴定载体筛选翻译产物转录产物其他方法（报告基因等）NorthernblottingWesternblotting标记补救筛选质粒载体的α互补筛选（蓝白色斑筛选法）噬菌体包装容量的正性筛选质粒载体的抗性标记筛选同源性分析鉴定（原位杂交）DNA序列分析重组子酶切图谱鉴定重组子大小鉴定添加标题遗传学检测法01添加标题抗药性标记插入失活筛选法03添加标题根据载体表型特征的筛选02添加标题第一节核酸分子的遗传学与物理检测法04克隆Kan抗性基因（2）β-半乳糖苷酶显色反应筛选法蓝白菌落蓝白菌落筛选白色菌落202Xlogo根据插入基因遗传性状的筛选重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就可以利用营养突变株进行筛选。合成某一aa的基因添加标题重组子添加标题生长、获得添加标题载体添加标题酶切添加标题连接添加标题重组添加标题缺少该aa合成酶基因的菌株添加标题转化添加标题只缺少该aa的基本培养基添加标题筛选添加标题二、核酸分子的物理检测法原理：碱基配对杂交双方：待测的核酸序列插入片段基因制备的DNA或RNA探针核酸杂交方法：菌落印迹原位（insitu）杂交斑点（dot）印迹杂交Southern印迹杂交都是通过一定的物理方法将菌落（噬菌斑）或突起的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持物上，然后同液体中的探针进行杂交。菌落印迹原位杂交将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态实验步骤Smad2mRNA在系膜增生型IgA肾病肾小球的表达原位杂交×200肺腺癌β-catmRNA原位杂交法×4002、斑点印迹杂交斑点印迹杂交与菌落原位杂交的原理相同将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上优点：简单、快速、可同时检测多个样品常用于病毒核酸的定量检测RNA或DNA变性NC膜固定杂交放射自