蛋白质的修饰和表达课件.pptVIP

蛋白質的修飾和表達第一節蛋白質修飾的化學途徑一、功能基團的特異性修飾I.?多位點取代II.單一的限制性取代III.次級取代二、基於蛋白質片段的嵌合修飾I.嵌合蛋白質—非共價締合系統II.二硫鍵與嵌合蛋白質的形成III.嵌合蛋白質—通過化學啟動形成肽鍵IV.嵌合蛋白質—通過酶連接反應形成肽鍵V.通過非肽鍵形成嵌合蛋白質一、功能基團的特異性修飾在20種天然氨基酸的側鏈中，大約有一半可以在足夠溫和的條件下產生化學取代而不使肽鍵受損，其中氨基、巰基和羧基特別容易產生有用的取代。因為任何給定的氨基酸殘基在蛋白質分子中可能出現不止一次，如果用化學的方法對氨基酸進行修飾時，正常情況下所有相關的氨基酸側鏈都要被取代。至於談到氨基和羧基基團，儘管處在側鏈上和末端基團的pK值有差別，但在化學上很難將肽鏈的?-氨基或?-羧基基團與側鏈上的氨基或羧基相區別。一、功能基團的特異性修飾1．多位點取代2．單一的或限制性取代3．次級取代1．多位點取代(1)常規的氨基保護(2)亞氨代乙醯基(3)其他的側鏈取代2．限制性取代(1)?-異硫氰酸苯酯對?-氨基的選擇性(2)羰基二醯肼的親核取代(3)蛋白醛(4)通過蛋白質水解的逆反應產生蛋白和肽的?-醯胺(5)蛋白醛—由糖的化學氧化產生3．次級取代(1)與蛋白醛偶聯—親核取代物(2)與蛋白質活性親核物偶聯—醛取代物二、基於蛋白質片段的嵌合修飾通過非共價鍵相互作用、二硫鍵、常規肽鍵(通過化學法或酶法產生)或其他非肽共價鍵，可以將較小的肽段連在一起，這就是通過半合成對蛋白質進行工程操作的原則。二、基於蛋白質片段的嵌合修飾1．通過非共價締合系統產生嵌合蛋白質2．二硫鍵與嵌合蛋白質的形成3．嵌合蛋白質—通過化學啟動形成肽鍵4．融合蛋白質—通過酶連接反應形成肽鍵5．通過非肽鍵形成嵌合蛋白質第二節蛋白質改造的分子生物學途徑一、編碼基因的專一性位點和區域性定向突變1.???????編碼基因的專一性位點突變2.???????區域性定向突變?二、基因融合和基因剪接1.???????利用基因融合技術表達外源基因的緣由2.???????基因融合的策略3.???????產生蛋白質分子嵌合體的方法4.???????蛋白質內含子介導的蛋白質分子間的連接?三、tRNA介導定點攙入非天然氨基酸基因突變技術是通過在基因水準上對其編碼的蛋白質分子進行改造，在其表達後用來研究蛋白質結構功能的一種方法。根據其特點，可將基因突變分為兩大類：位點特異性突變和隨機突變。位點特異性突變又可大體分為三種類型：一類是通過寡核苷酸介導的基因突變；第二類是盒式突變或片段取代突變；第三類是利用聚合酶鏈反應(PCR)，以雙鏈DNA為範本進行的基因突變。可以這樣說，PCR技術的出現為基因的突變，基因的剪接開闢了一條極其有效、極其快捷的道路。當然無論哪種方法都可以在為蛋白質編碼的基因序列上產生插入、缺失、取代等突變。1．編碼基因的專一性位點突變專一性位點突變又稱特異性位點突變。這類突變都是在含有突變序列的寡核苷引物介導下進行的，因此又稱為寡核苷酸介導的位點特異性突變。這種突變的方法從問世至今不斷更新，特別是PCR技術出現後變得更高效。(1)寡核苷酸介導的基因突變中的各種因素(2)幾種寡核苷酸介導的基因突變方法(2)幾種寡核苷酸介導的基因突變方法①Kunkel突變法②基於抗生素抗性“回復”的突變方法③基於去除特定限制酶切位點的突變④利用聚合酶鏈反應(PCR)產生定點突變2．區域性定向突變基因工程技術不但可使基因產生特異性位點突變，也可以產生區域性的突變。常用的方法如盒式突變法(cassettemutagenesis)，又稱片段取代法(DNAfragmentreplacement)。這一方法的要點是利用目標基因中所具有的適當的限制性內切酶位點，用具有任何長度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段來置換或取代目標基因上的一段DNA序列。研究目的通過改變幾個氨基酸序列來研究蛋白質的結構-功能之間的關係，也可以通過盒式突變法產生嵌合蛋白質。在這個嵌合蛋白質中，蛋白質分子中的整個結構域都可以用完全不同的氨基酸序列來置換。盒式突變最主要的用途是產生各種特異性的突變或突變家族，在這些突變體中各種不