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蛋白質沉澱法

1概述定義 常用加入試劑的方法，改變溶劑和溶質的能量平衡來降低其溶解度，使產物離開溶液生成不溶性顆粒，沉降析出。沉澱具有濃縮與分離的雙重作用。與結晶聯繫在本質上都是新相析出的過程，主要是物理變化，當然也存在化學反應的沉澱或結晶。區別 結晶為同類分子或離子以有規則排列形式析出，沉澱為同類分子或離子以無規排列形式析出。

1概述優點A、設備簡單、成本低、放大容易，產物濃度越高沉澱越有利，收率越高；B、原料液體積很快地減小10~50倍，從而簡化生產工藝、降低生產費用；C、使中間產物保持在一個中性溫和的環境；D、及早地將目標pro.從其pro.水解酶分離出來，避免pro降解，提高產物穩定性；E、用沉澱法作為pro色譜分離前處理，可使使用色譜分離的限制因素降低到最少。缺點：A、沉澱物可聚集有多種物質，如大量鹽類和溶劑，所以沉澱法所產品純度通常都比結晶法低；B、過濾較困難

2蛋白質溶解蛋白質溶解：相似者相溶aa的親水性和疏水性：有利因素：親水性，包括氫鍵、極性基團、離子化側鏈、親水aa所占的%等。如白蛋白不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基團、疏水aa所占的%等。如纖維蛋白原。

1)、水化層(hydrationshell) tighthydrationshell(0.35gwater/1gpro) loosehydrationshell(2gwater/1gpro)2)、靜電排斥 ?zeta電勢 NernstPotential—膠核表面電位(不可測) SternPotential—(不可測) ?Potential—滑面電位(可測,mobility) ?電位 Nernst電位ionicstrength3)、|pH水–pI|Value |pH水–pI|Value?zeta電勢?水化層?靜電排斥?TighthydrationshellProteincoreLoosehydrationshell

4蛋白質沉澱方法分類1）、鹽析法2）、有機溶劑沉澱法3）、|pH水–pI|Value調節法4）、親水聚合物沉澱法5）、聚電解質絮凝法6）、高價金屬離子沉澱法7）、親和沉澱法

5鹽析法機理：A、?zetapotential；B、?hydrationshell

5鹽析法計算:Cohnx經驗公式 式中,S為蛋白質的溶解度(g/L)；I為離子強度；m為鹽的摩爾濃度；β值為蛋白質在純水中(I=0時)的假想溶解度對數值，是pH值和溫度的函數，在蛋白質pI時最小；Ks為鹽析常數，與溫度和pH值無關。

5鹽析法方法:A、“Ks”分級鹽析法：在一定pH值及溫度下，改變鹽濃度（即I）達到沉澱的目的。B、“β”分級鹽析法：在一定I下，改變溶液的pH值及溫度達到沉澱的目的。C、應用：一般的初步分離用第一種方法，進一步純化時用第二種方法。

5鹽析法影響因素A、無機鹽種類感膠離子序(Hofmeister序列):In1888，Hofmeister對一系列鹽沉澱蛋白質的能力進行了測定研究。陰離子排序為：檸檬酸根3-酒石酸根3-F-IO-3H2PO-4SO-4CH3COO-Cl-ClO-3Br-NO-3ClO-4I-CNS-;對陽離子排序為：Th4+Al3+H+Ba2+Sr2+Ca2+Cs+Rb+NH4+K+Na+Li+如何設計實驗？結論？

5鹽析法結論：a 不同種類的鹽主要影響Ks；b 離子半徑小，帶電多，電荷密度高，鹽析效果好。無機鹽的挑選原則：a 較高的鹽析效能；b 高溶解度，能配置高離子強度的鹽溶液；c 溶解度受溫度的影響小；d 鹽溶液的密度不高，便於蛋白質沉澱和離心分離；e 不易引起蛋白質的變性；f 價格低廉；最常用(NH4)2SO4。優點：符合上述要求；缺點：水解後溶液pH降低，在高pH下產氨，腐蝕性強，有異味，有毒，終產物必須除盡。次常用Na2SO4。缺點：在400C以下溶解度較低，主要用於熱穩定蛋白。

5鹽析法B、無機鹽添加方式

5鹽析法C、溫度T T影響Cohn方程中的?值。T?，??；T?，??。 Why? 一般…， 現在…

5鹽析法D、溶液pHpH影響Cohnx方程中的?值。見圖圖有何用？

6等電點沉澱法等電點沉澱法中的pH值作用於β值而隱含在Cohnx公式中，pI值通常在pH4~6範圍內變化