碱性磷酸酶的分离提取.ppt

Page?*Page?*第1页，共19页，星期日，2025年，2月5日*碱性磷酸酶广泛存在于微生物界和动物界。碱性磷酸酶能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。第2页，共19页，星期日，2025年，2月5日*如何获取碱性磷酸酶碱性磷酸酶（AKP）溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离，从而得到纯化。反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。第3页，共19页，星期日，2025年，2月5日*

1.综合运用有机溶剂沉淀、离心、分光等方法，从组织中分离纯化及鉴定特定蛋白质的技能。2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及鉴定的方法实验目的第4页，共19页，星期日，2025年，2月5日*

实验原理碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解生成酚和磷酸盐。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类衍生物，其颜色深浅与AKP活性成正比。第5页，共19页，星期日，2025年，2月5日*碱性磷酸酶的提取称取兔肝2g,剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入0.01mol/L的醋酸镁及醋酸钠混合液4ml,进行匀浆。将其转入离心管，并加2ml0.01mol/L的醋酸镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒入离心管，与原来的匀浆液混合。记录体积a，取0.1ml作为A液于EP管，待测比活性用。第6页，共19页，星期日，2025年，2月5日*碱性磷酸酶的提取在离心管中剩余的液体加入2ml正丁醇，玻璃棒搅拌2min，室温放置30min，纱布过滤，置于离心管。第7页，共19页，星期日，2025年，2月5日*碱性磷酸酶的纯化滤液加入等体积的冷丙酮，边倒边摇，混匀后3000r/min5min。弃上清，沉淀用4ml0.5mol/LMg(AC)2溶解。记录体积b。取0.1ml作为B液于EP管，待测比活性用。在悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%（0.46体积），混匀后2000r/min5min，转移上清液于另一离心管。上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60%（0.85体积），混匀后3000r/min5min，沉淀用4ml0.01MMg(AC)2、NaAC混合液搅拌混悬。第8页，共19页，星期日，2025年，2月5日*碱性磷酸酶的纯化其余悬液中缓慢加入冷丙酮，使得丙酮的体积分数达到33%（0.5体积），混匀后2000r/min离心5min，取上清液丢弃沉淀。上清液中缓慢加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到50%(0.34体积），混匀后3000r/min离心15min。沉淀中加入Tris-醋酸镁缓冲液5ml，即为纯化酶液。作为D液用于比活性测定。第9页，共19页，星期日，2025年，2月5日*第10页，共19页，星期日，2025年，2月5日*碱性磷酸酶活性的鉴定磷酸苯二钠磷酸盐+酚酚+4-氨基安替比林红色醌类衍生物AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解磷酸基团。最适pH范围为8.8~10,需要镁离子作为激活剂。AKP铁氰化钾第11页，共19页，星期日，2025年，2月5日*第12页，共19页，星期日，2025年，2月5日*管号空白标准ABCD酶液体0.10.10.10.1酚标准液0.1Tris-Mg(AC)20.1复合底物3.03.03.03.03.03.0第13页，共19页，星期日，2025年，2月5日*加入底物后,立即混匀,37℃准确15min后加入0.5%铁氰化钾2.0ml终止反应,混匀,静置15