3基因工程制药技术.pptx

第二章基因工程制药技术;获得目的基因;基因工程菌构建流程;一表达载体构建;1.表达载体的设计;2、目标基因PCR定位克隆;PCR循环;;3.酶切反应和连接反应;4.转化、筛选与鉴定;筛选方法;;b.双抗生素筛选;;;;;;菌落原位杂交的原理;鉴定方法;二基因工程菌的构建;1.大肠杆菌表达系统;;基因工程大肠杆菌的应用;PEG;2.酵母表达系统;;基因工程酵母的应用;水蛭素;;三基因工程菌的培养与发酵;碳源;氮源;无机盐;选择剂selectiveagent;诱导物;2.培养工艺与控制;大肠杆菌和酿酒酵母生长最低温度为10℃

大肠杆菌生长最适温度为37℃，最高温度为45℃。

酿酒酵母生长最适温度为30℃，最高温度为40℃。;两段变温发酵培养：

前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度；

后期：较低温培养发酵，对菌体合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成，总体提高工程菌的生产能力。

温度诱导型大肠杆菌表达系统：生长期维持37℃，生产期提高温度42℃。;pH值对发酵的影响;pH值控制;溶解氧控制;四重组人干扰素生产工艺;广谱抗病毒活性（rhuIFNα）

慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。

直接抗肿瘤活性（rhuIFNα）

??毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。

免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ）

多发性硬化症rhuIFNβ;体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞;人源转化细胞系培养生产工艺：;;;;五转基因动物技术;经典的技术路线?

目的基因

显微注射

?

已交配的取出移植受体动物妊娠

供体动物受精卵输卵管转基因动物

缺点：注入目的基因的命中率低，目的基因的整合率低，受精卵移植的受孕率低。;?整合胚胎移植的技术路线

转基因动物受体动物子宫

目的基因非手术

胚胎移植

?

体外受精体外培养多细胞胚胎检测整合外源??因

卵子受精卵或囊胚的胚胎

精子

优点：受精卵的成活率高达90％以上，外源基因整合率高，提高受孕率。;?转基因动物的技术路线（续）;?转基因动物的技术路线（续）;目的基因的制备和转基因的方法;显微注射法

显微注射法是在显微注射仪上，一侧用吸管固定受精卵，另一侧将注射针插入受精卵原核（一般是雄原核）。拔出显微注射针解除固定管的负压，操作完成。

显微注射法是最早使用、至今仍在使用的较成熟的基因导入方法。其缺点是：整合效率低（小于1%）；不能定点整合，影响基因表达和遗传稳定性；方法复杂、设备昂贵。

?

;生殖细胞载体法

有体外和体内转染生殖细胞的两种方法，前者又包括精子载体法、卵子载体法、受精卵载体法、胞浆内精子注射法等。

精子载体法是将成熟的精子与外源DNA的载体共同孵育，使精子携带外源DNA，受精后外源DNA整合至染色体中。

此法理论上是可行的、也有成功的先例，但成功率不高、效果不稳定，有待继续探索、完善。

;胚胎干细胞介导法

胚胎干细胞（embryonicstemcell，ES细胞）是从胚泡内细胞团分离得到的多潜能细胞。

将外源基因导入体外培养的ES细胞，经筛选后获得整合稳定和表现良好的细胞，将这些细胞注射到小鼠胚泡腔中，部分ES细胞可与内细胞团融合并参与其分化，形成嵌合体。

在嵌合过程中，带有外源基因的ES细胞可能进入生殖系，在经杂交育种可得到纯合体，即为所需的转基因小鼠。

;病毒载体法

细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中扩增和表达。动物病毒载体是较理想的真核基因工程载体。

病毒DNA序列中有很强的启动子，可使其后方的外源基因高产量和高频率地表达。常用的有杆状病毒载