自然选育和诱变育种.ppt

（三）筛选步骤1－预筛1琼脂块法预筛琼脂块制备:在直径9cm平皿中定量加入30mL基础培养基,冷却凝固后用直径6mm打孔器打好琼脂块，然后用竹签把琼脂块移至直径9cm空平皿中单菌落点接琼脂块和培养:挑取Ⅰ型菌落，或形态变异明显的菌落，点接到琼脂块上.每次诱变最少挑200株.把以上平皿置于保湿盒内，28℃培养2d，使活性物质积累于琼脂块中;琼脂块生测:把培养好的琼脂块移到生测平板上，28℃培养2d,测量抑菌圈直径.每生测平板挑取抑菌圈最大的菌落2~3个，接种斜面,每次诱变最少挑50株.第55页，共65页，星期日，2025年，2月5日饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物能力，工具菌就能围绕该菌生长待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质第23页，共65页，星期日，2025年，2月5日第三节营养缺陷型突变体的筛选及应用一、营养缺陷型：指通过诱变而产生的丧失了合成某种营养物质的能力，必须在基本培养基中加入相应缺陷的物质才能正常生长的变异菌株。第24页，共65页，星期日，2025年，2月5日二、筛选营养缺陷型的培养基：基本培养基[-]:凡是能满足某种野生菌株营养要求最低成分的合成培养基。完全培养基:凡能满足一切营养缺陷株营养需要的培养基[+]。第25页，共65页，星期日，2025年，2月5日补充培养基[A]：只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基。第26页，共65页，星期日，2025年，2月5日三、营养缺陷型菌株筛选的一般方法1.诱变处理2.淘汰野生型第27页，共65页，星期日，2025年，2月5日A、抗菌素法:将抗生素加入到基本培养基中，杀死生长野生型菌株，浓缩营养缺陷型。用加有青霉素的基本培养基分离培养诱变处理后的菌体，野生型菌株因为繁殖产生的子细胞不能合成正常细胞壁而死亡，而对不能繁殖的营养缺陷型细胞因为在基本培养基中不能繁殖而得以保留。第28页，共65页，星期日，2025年，2月5日酵母菌：用加有制霉菌素基本培养基分离培养诱变处理后的菌体，制霉菌素抑制真菌细胞壁中甾醇合成，从而使繁殖中的细胞产生的子细胞死亡，保留营养缺陷型细胞。第29页，共65页，星期日，2025年，2月5日B、菌丝过滤法:诱变后的孢子在[—]中培养一段时间后过滤，去除大部分野生型菌株，浓缩营养缺陷型。Sartorius正压式过滤器真菌和放线菌等丝状菌的野生型菌株在基本培养基中产生菌丝体，而营养缺陷型菌株以孢子形式存在，不能萌发。把诱变处理后的孢子悬液用液体基本培养基培养，适温振荡培养，使野生型孢子萌发形成菌丝体，用灭菌脱脂棉、滤纸等除去菌丝体，再培养，再过滤。重复3～4次，最大限度地除去野生型菌株，然后再分离第30页，共65页，星期日，2025年，2月5日三、检出所需缺陷型逐个检出法经诱变处理后的细胞涂布在平板上，待长出单个菌落后，用接种针将这些单个菌落逐个依次地分别接种到基本培养基和另一完全培养基。经培养后，如果在完全培养基上的某一部位上出现菌落，而在基本培养基上却不长菌，说明这是一个营养缺陷型。第31页，共65页，星期日，2025年，2月5日三、检出所需缺陷型影印培养法将长出菌落的平皿开口朝下，在丝绒布上轻轻地印一下，把此皿上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。经培养后，比较这两个平皿上长出的菌落，如果发现前一平皿上某一部位长有菌落，而在后一培养基的相应部位上却没有，说明这就是一个营养缺陷型。第32页，共65页，星期日，2025年，2月5日第33页，共65页，星期日，2025年，2月5日一般从菌落大小也可以判断，新长出的菌落较小，即是营养缺陷型夹层培养法A、夹层培养法:先在培养皿中倒一薄层不含菌的基本培养基，待冷凝后加上一层含诱变处理菌液的基本培养基，其上再浇一薄层不含菌的基本培养基。经培养后在培养皿底用笔对首次出现的菌落作记号，然后再在其上倒一薄层完全培养基。再经培养后所出现的新菌落，多数为营养缺陷型。第34页，共65页，星期日，2025年，2月5日四.鉴定营养缺陷型生长谱法第35页，共65页，星期日，2025年，2月5日方法一：把纯化好的缺陷型菌株与基本培养基倒混合平板或涂布平板，再在平板上点接各种