荧光定量技术临床应用.ppt

血清（浆）DNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大RNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制，且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（1～2周）保存可在-20℃下，较长期保存应在-70℃下第31页，共52页，星期日，2025年，2月5日全血以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素全血样本如用于DNA提取检测,可4℃下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA第32页，共52页，星期日，2025年，2月5日外周血单个核细胞外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于-70℃下第33页，共52页，星期日，2025年，2月5日痰痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定标本痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时,需对样本进行初步处理，即用1mol/LNaOH或变性剂液化如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70℃下第34页，共52页，星期日，2025年，2月5日棉拭子在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置5～10分钟,待大块状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。如不立即用于核酸提取,则需保存于-70℃下.第35页，共52页，星期日，2025年，2月5日脓液脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水洗2～3次后,即可用于DNA提取对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直接离心取沉淀即可。沉淀标本的保存条件同样为-70℃第36页，共52页，星期日，2025年，2月5日体液临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本的保存同上。第37页，共52页，星期日，2025年，2月5日关于荧光定量技术临床应用第1页，共52页，星期日，2025年，2月5日内容提要一、基因诊断技术在医学检验中的地位二、荧光探针定量PCR在临床医学中的应用三、荧光探针定量PCR在临床医学中的主要问题第2页，共52页，星期日，2025年，2月5日基因诊断的物质基础及与其它

诊断方法的区别基因诊断免疫学诊断临床诊断细胞膜细胞核DNA转录mRNA翻译蛋白质临床表现生化诊断第3页，共52页，星期日，2025年，2月5日临床实验医学发展三个时代标志技术性质生化诊断时代生化分析表象免疫学诊断时代酶免、放免表象分子(基因)诊断时代基因体外扩增(PCR)本质第4页，共52页，星期日，2025年，2月5日1、病原体的定量检测及药物疗效考评（HBV）2、肿瘤基因和肿瘤标志物表达(mRNA)的检测（P53）3、遗传病基因的检测（地中海贫血）4、与疾病相关的各种蛋白质的基因表达的定量检测6、建立病原体的分子诊断标准荧光定量PCR在临床医学中的应用第5页，共52页，星期日，2025年，2月5日荧光定量PCR在病原体检测中的应用一、肝炎病毒定量检测二、性病病原体检测三、优生优育相关项目检测四、结核杆菌及呼吸道病原体检测五、其他病原体检测第6页，共52页，星期日，2025年，2月5日病毒性肝炎概况病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起，以肝脏炎症和坏死病变为主的一组传染病。按病毒的生物学特征、临床和流行病学特征，1989年在日本东京的国际肝炎学术讨论会上，将其分为甲（A）型、乙（B）型、（C）型、丁（D）型、戊（E）型肝炎，以后还报道了己（F）型和庚（G）型。我国是个肝炎大