浑浊红球菌PD630中苯酚羟化酶基因的鉴定及功能研究.pdf

华中科技大学硕士学位论文

摘要

浑浊红球菌PD630（RhodococcusopacusPD630）能耐受和降解多种木质素衍生

芳香化合物，已被应用于木质素高值转化的研究。苯酚存在于多种木质素的解聚产物

中，其亚结构和毒性水平在木质素衍生芳香化合物中具有代表性，是研究木质素衍生

芳香化合物降解机制的一种模型化合物。已有很多研究对R.opacusPD630降解苯酚

的机制进行了探究，发现PheB1A1（LPD06740/LPD06741）与PheB2A2

（LPD06576/LPD06575）可能是R.opacusPD630降解苯酚的关键基因簇，但目前还

没有对PheB1A1与PheB2A2进行鉴定及功能研究的报道，限制了对R.opacusPD630

降解木质素衍生芳香化合物机制的理解。因此，本文对R.opacusPD630中的PheB1A1

与PheB2A2进行了鉴定与功能研究，证实了PheB1A1与PheB2A2是R.opacusPD630

中的苯酚羟化酶基因簇。主要研究结果和结论如下：

通过实时荧光定量PCR检测R.opacusPD630在苯酚中生长时PheB1A1与

PheB2A2的表达水平，发现它们的表达水平在生长的迟缓期和指数期均出现上调，

并且PheB2A2的上调程度高于PheB1A1，表明PheB1A1与PheB2A2的表达均受苯

酚的显著调控，且PheB2A2受苯酚的诱导程度更高。敲除PheB1A1与PheB2A2后R.

opacusPD630丧失了利用苯酚生长的能力，而在双敲除菌株中回补PheB1A1或

PheB2A2都可恢复对利用的苯酚能力，表明PheB1A1与PheB2A2在R.opacusPD630

利用苯酚生长的过程中发挥着关键作用。此外，表达PheB1A1可使双敲除菌株在相

对低表达水平的情况下更快地利用苯酚生长，表明PheB1A1与PheB2A2在催化苯酚

的效率上存在差异。

对PheB1A1与PheB2A2中PheA1与PheA2的氨基酸序列进行了生物信息学分

析，二者的序列相似性为92.19%，系统发育分析结果显示它们与双组分苯酚羟化酶

中单加氧酶的进化关系较近，保守序列分析结果显示它们都具有双组分黄素扩散单

加氧酶（Two-componentflavin-diffusiblemonooxygenase，TC-FDM）的保守序列，

PheA1与PheA2三维结构的预测结果表明它们可能以同源四聚体形式存在，与苯酚

I

华中科技大学硕士学位论文

的分子对接结果表明它们可能通过TC-FDM中的保守残基Arg-135、Tyr-139和His-

177与苯酚发生相互作用。对PheA1和PheA2酶学性质的研究结果表明，其它来源

的黄素还原酶（EcHpaC）可以使PheA1和PheA2发挥催化活性，PheA1的酶活性约

为PheA2的2倍，二者均为双组分FAD依赖性单加氧酶，反应体系中适用的电子供

+

体均为NADH，额外添加NAD会抑制它们的酶活性。二者的最适反应温度均为30℃，

均在低温条件下稳定性较好、高温条件下较差，且PheA1的温度稳定性优于PheA2，

此外，PheA1和PheA2还能催化4-香豆酸等木质素衍生酚类化合物。

综上所述，本研究证实了PheB1A1与PheB2A2是R.opacusPD630中的苯酚羟

化酶基因簇，进一步解析了R.opacusPD630降解苯酚的机制，丰富了对R.opacus

PD630降解木质素衍生芳香化合物机制的研究，为木质素衍生芳香化合物的降解和

资源化利用提供了新的催化元件和理论基础。

关键词：浑浊红球菌PD630；苯酚羟化酶；基因功能；芳香化合物；木质素

II