微专题基因工程热点突破基因工程的基本操作程序课件高二下学期生物人教版选择性必修3.pptx

微专题：基因工程中几个热点分析;;;;;EcoRI和BamHI?;;EcoRI和HindIII;;;;;;;;;;【例8】用DNA连接酶把被限制酶l(识别序列和切点是-↓GATC-)切割过的运载体和被限制酶Ⅱ(识别序列和切点是-G↓GATC-)切割过的目的基因连接起来后,该重组DNA分子能够再被限制酶Ⅱ切割开的概率是:（）

A.1/2

B.7/16

C.1/16

D.1/4;;;;;;;1.扩增DNA片段（从DNA分子中扩增特定片段——引物的选取）

2.DNA测序（分别以4对ddNTP、dNTP为原料，PCR得到特定碱基为末端的片段，电泳分析）

3.DNA检测（只检测存在与否用荧光PCR，若检测量进行实时荧光定量PCR）

RNA检测（RT-PCR，只检测存在与否用荧光PCR，若检测量进行实时荧光定量PCR）

4.扩增并在5’端修饰限制酶位点或启动子序列（需要设计引物，在两种引物5’端加限制酶识别序列或启动子序列）

5.扩增未知序列（反向PCR，利用已有已知序列或修饰上已知片段后，对已知序列两侧的未知序列PCR）

6.DNA片段拼接（重叠PCR）

7.大分子扩增（重叠PCR）

8.定点突变（在引物对应目的基因内部区域，设计个别碱基与模板不配对碱基。引物5’端修饰、重叠延伸PCR、大引物PCR）

9.重组DNA（交错延伸PCR）

10.获得大量单链探针（不对称PCR）

11.提高产物特异性（递减PCR、巢式PCR、降落伞PCR缩小范围海选）

12.基因定位（系列引物PCR，转基因表达检测）;1.DNA片段扩增获取目的基因略;5’3’;5’3’;PCR应用类型简介（含基因定位）;1.DNA片段扩增获取目的基因略;[例]基因检测是指通过检测生物体中的DNA序列,以了解生物体基因状况的技术于段。Sanger双脱氧链终止法是DNA测序的基本方法,其原理是:核酸模板在核酸聚合酶、带有3-OH末端的单链核苷酸引物、四种dNTP存在的条件下复制或转录时,如果在反应系统中分别引人单一种类的ddNTP(即2,3双脱氧核苷三磷酸,在脱氧核糖的3位置缺少一个羟基,故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键),只要ddNTP参入链端,该链就停止延长,链端掺入dNTP的片段可继续延长。通过电泳将不同长度的片段分开,DNA片段越小,距离起点越远,根据末端核苷酸可得到原始序列信息。具体流程如图。;(1)若待测核酸模板为双链DNA,首先要作处理,与引物??合后,在DNA聚合酶作用下子链沿方向(填“5端向3端”或“3端向S端”)进行延伸反应。若待测核酸模板为RNA,则需要在酶的帮助下合成DNA单链片段。

(2)ddNTP为2,3-双脱氧核苷三磷酸,只要ddNTP接入链端,该链就停止延长的原因是.

(3)假设某反应体系中,待测DNA单链序列3‘-GTACCCTA-5’,加人4种dNTP和ddATP,经过双脱氧链终止法处理,会得到

种片段,其中最短的片段序列是。

(4)假设某次Sanger双脱氧链终止法测序得到的电泳图如上图所示,则待测DNA序列从5‘端到3’端为_。;;CT值大小，反映测定初始的核酸浓度;[例]实时荧光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸检测,其原理是:在PCR复性过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基团和抑制荧光发岀的淬灭基团，新链延伸过程中,DNA聚合酶会破坏探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发岀荧光。利用RT-PCR进行核酸检测的相关过程如图所示。下列说法错误的是();4.扩增并在5’端修饰限制酶位点或启动子序列;[例](多选)通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点突变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。有关叙述正确的是();5.扩增未知序列——反向PCR;;[例]反向PCR可扩增已知序列两端的未知序列。如图所示，在一段未知序列的突变体DNA片段中，插入了已知序列的T-DNA，要想对